氮源對葡萄酒酵母發(fā)酵性能影響的研究進展

原夢夢，李金宸*，李賀賀，孫寶國

（1.北京工商大學(xué) 中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

葡萄酒是一種以葡萄為原料的發(fā)酵型含酒精飲料，歷史悠久，可追溯至公元前5 400年[1]。從早期的自然發(fā)酵，到現(xiàn)代大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，酵母在發(fā)酵過程中扮演著重要的角色。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是參與葡萄酒發(fā)酵的主要微生物，在執(zhí)行酒精發(fā)酵的同時通過生成發(fā)酵香氣物質(zhì)賦予葡萄酒復(fù)雜多樣的風(fēng)味。隨著微生物風(fēng)土的提出，自20世紀90年代起，發(fā)酵特性多樣的非釀酒酵母（non-Saccharomycesyeasts）逐漸受到關(guān)注[2]。非釀酒酵母是參與葡萄酒發(fā)酵的、除釀酒酵母外的其他酵母品種，早期一度被認為是污染酵母[3]；隨著研究的深入，其在發(fā)酵中的積極作用逐漸被揭示[3]。此類酵母的優(yōu)良發(fā)酵特性包括改善葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)、增加葡萄酒生物穩(wěn)定性等，并通過生理代謝高產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)，體現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)、品種葡萄酒的風(fēng)土特異性。盡管大多數(shù)非釀酒酵母對酒精耐受力低，不能獨立完成酒精發(fā)酵，但是在與釀酒酵母混合發(fā)酵中可以發(fā)揮其特點，改善葡萄酒特性，提升葡萄酒品質(zhì)。

酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中有特定的營養(yǎng)需求。在影響酵母發(fā)酵的眾多營養(yǎng)因素中，氮源作為葡萄的內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)，對酵母的生長代謝、發(fā)酵速率以及發(fā)酵香氣的產(chǎn)生等有重要影響，是發(fā)酵過程中除碳源外的主要營養(yǎng)物質(zhì)[4]。在葡萄酒發(fā)酵基質(zhì)中，可被酵母直接利用的氮源稱為酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN），主要包括除脯氨酸外的α-氨基酸、小分子多肽以及銨態(tài)氮[5]在內(nèi)的有機氮和無機氮。在酒精發(fā)酵過程中，酵母吸收利用YAN及其他營養(yǎng)物質(zhì)，以支持其生長、發(fā)酵等生理代謝活動，并產(chǎn)生包括發(fā)酵香氣在內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物；研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵基質(zhì)中120～140 mg N/L YAN可保證釀酒酵母正常發(fā)酵，并對酒的質(zhì)量產(chǎn)生積極影響[6-7]。氮源含量過低會引起酵母生長停滯，從而導(dǎo)致發(fā)酵終止[8]，及時補充氮源可解決該問題。此外，氮源的組成與含量直接影響酵母發(fā)酵香氣的生成，進而對葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生影響；如酵母氮代謝所產(chǎn)生的雜醇、酯類等揮發(fā)性物質(zhì)，在低濃度時可增加葡萄酒香氣復(fù)雜性，濃度過高時則會產(chǎn)生香氣掩蓋作用[9]。因此，解析酵母氮利用特性，闡明其代謝途徑與調(diào)控機理可為實際生產(chǎn)中氮源管理及風(fēng)味物質(zhì)的定向調(diào)控提供理論支撐，并為釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵中的營養(yǎng)競爭機制研究奠定基礎(chǔ)。

本文圍繞葡萄酒酵母產(chǎn)香能力及氮源對于酵母的生長及發(fā)酵性能的影響進行總結(jié)，就目前的研究進展與未來研究方向展開論述，以期為我國葡萄酒酵母的發(fā)酵及產(chǎn)香特性的深入挖掘與研究提供借鑒與參考。

1 氮源條件對釀酒酵母生長和代謝的影響

在葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母對于葡萄酒的品質(zhì)有著至關(guān)重要的影響。酵母的生長周期分為遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段，與發(fā)酵速率密切相關(guān)。酵母在對數(shù)期與穩(wěn)定期發(fā)酵旺盛，進入衰亡期后其發(fā)酵速率降低，并逐漸停滯。氮源通過直接影響酵母生長，從而影響發(fā)酵活動。因此，為確保發(fā)酵順利進行，基于氮源對酵母生長與發(fā)酵速率影響的相關(guān)研究尤為重要。

氮源對于釀酒酵母生長及推動酒精發(fā)酵至關(guān)重要，在此基礎(chǔ)上，酵母氮代謝是產(chǎn)生發(fā)酵香氣的主要途徑。發(fā)酵香氣又稱二級香氣，是酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中通過生理代謝活動產(chǎn)生的一類揮發(fā)性香氣物質(zhì)，對于葡萄酒總體香氣的復(fù)雜性有重要貢獻，雜醇類和酯類是其中重要的組成物質(zhì)。雜醇類物質(zhì)由葡萄糖代謝和氨基酸脫氨產(chǎn)生，異戊醇、2-苯乙醇和異丁醇等是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)，其閾值較低，具有較強的香氣貢獻度；酯類物質(zhì)的形成與脂肪酸的生物合成和氨基酸代謝相關(guān)，包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯等，是構(gòu)成葡萄酒發(fā)酵香氣的重要物質(zhì)[10]。這些香氣物質(zhì)在適當(dāng)濃度下可增添葡萄酒香氣復(fù)雜性，對葡萄酒質(zhì)量有積極影響。

在葡萄酒釀造過程中，氮源不僅影響釀酒酵母生長及發(fā)酵進程，還可通過影響其代謝來調(diào)節(jié)發(fā)酵香氣的生成，從而影響葡萄酒的品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，不同釀酒酵母對氮源需求不同，氮源對其生長和發(fā)酵影響存在菌株特異性。不同氮源條件對釀酒酵母的生長、發(fā)酵速率和發(fā)酵香氣產(chǎn)量的影響見表1。

表1 不同氮源條件下釀酒酵母菌株的生長及代謝特性Table 1 Growth and metabolic performances of Saccharomyces cerevisiae strains under different nitrogen sources

續(xù)表

續(xù)表

1.1 初始氮源對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質(zhì)中初始氮源的組成和含量可直接影響釀酒酵母的生長及發(fā)酵性能，且該影響有菌株特異性。

初始氮源的組成是重要影響因素之一。S.cerevisiaeEC1118在模擬葡萄汁的氮源條件下相較等比例的氨基酸與銨混合氮源條件下的發(fā)酵速率更快，完成發(fā)酵時間更短，但發(fā)酵香氣包括異戊醇、乙酸乙酯和乙酸異戊酯在等比例混合氮源條件下的產(chǎn)量更高[14]；其在不同氮源間生物量差異顯著，在含有不同氮源的合成培養(yǎng)基中生物量最高，僅含單一氮源時生物量較低，尤其是以銨為單一氮源生物量最低[26]；此外在該菌株以24種氮源分別作為單一氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，以蛋氨酸為單一氮源時發(fā)酵香氣產(chǎn)量最高[15]。S.cerevisiaeUCD522與S.cerevisiaePYCC4072的表現(xiàn)相似，兩者的發(fā)酵速率與初始氮源組成無關(guān)，但發(fā)酵香氣的產(chǎn)生受氮源組成影響較大，2-苯乙醇、異戊醇、2-乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯在以銨鹽為初始氮源時產(chǎn)量高于氨基酸為初始氮源[9]。S.cerevisiaeViniferm Revelación在混合氮源（銨與氨基酸）中比在單一氮源（僅存在銨或氨基酸）條件下更快完成發(fā)酵；然而其在以氨基酸為氮源的培養(yǎng)基中生物量積累以及發(fā)酵速率比非釀酒酵母均更高，而在混合氮源或僅有銨態(tài)氮時生長無顯著差異[25]。不同發(fā)酵性能的釀酒酵母對氮源的利用存在較大差異，這可能與釀酒酵母的氮代謝調(diào)控機制相關(guān)，其促使釀酒酵母偏好性地選擇有利于其生長發(fā)酵的氮源。

初始氮源的含量對釀酒酵母的生長和發(fā)酵表現(xiàn)同樣有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，初始氮源含量為60～140 mgN/L時，S.cerevisiaevar.cerevisiaePDM，RVA，TTA和S.cerevisiaevar.uvarumARM的發(fā)酵速率隨氮源含量升高而增強，氮源含量為200～300 mg N/L時，發(fā)酵速率無顯著變化[24]。S.cerevisiaePYCC4072在不同初始氮含量下（66～805 mg N/L）的生長無顯著差異，但其發(fā)酵在低氮條件下（16.5～33 mg N/L）停滯，隨著氮含量升高，其發(fā)酵速率逐步提高，在高氮條件下（805 mg N/L）最快完成發(fā)酵，但會有氮殘留[12]；也有研究表明，其在氮限制條件下（90 mg N/L）發(fā)酵速率緩慢[13]。S.cerevisiaeEC1118的生長速率隨初始氮源濃度的升高而加快，且在高氮條件下的生物量積累顯著高于低氮條件；其酯類物質(zhì)的總產(chǎn)量隨著初始氮源濃度的降低而減少，其中乙酸酯含量明顯高于乙基酯的含量[16]。S.cerevisiaeLalvin QA23 R在不同初始氮源含量下的酵母生長無顯著差異，但在氮含量較高時發(fā)酵速率明顯高于低氮條件[21]；并且氮含量的提高對其醇、酯類物質(zhì)的產(chǎn)量有積極影響[20]。S.cerevisiaeAWRI 796的發(fā)酵速率相比于高氮條件，在低氮條件下受氮含量影響更大，其丙酸乙酯在初始氮含量高于117mgN/L時產(chǎn)量顯著下降，乙酸乙酯在氮源含量為200～300 mg N/L產(chǎn)量最低，而S.cerevisiaeM05的發(fā)酵速率在高氮條件下的變化更為顯著，其丙酸乙酯在較低氮含量下產(chǎn)量較高，在300 mg N/L時產(chǎn)量最低，乙酸乙酯在高氮條件下的產(chǎn)量最高[23]，兩者表現(xiàn)在一定程度上體現(xiàn)了菌株特異性。此外有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質(zhì)中初始氮含量超過一定水平會造成部分雜醇類物質(zhì)的產(chǎn)量下降[11]。因此，葡萄酒釀造中可以通過控制氮含量使發(fā)酵速率達到較高水平，同時調(diào)節(jié)發(fā)酵香氣的產(chǎn)生，使發(fā)酵向利于葡萄酒品質(zhì)提升的方向進行。

初始氮源的含量與組成類型對釀酒酵母生長、發(fā)酵性能及產(chǎn)香能力均有不同影響。然而，關(guān)于初始氮源對酵母發(fā)酵的影響仍缺乏相關(guān)機制研究。此外，葡萄酒發(fā)酵基質(zhì)組成復(fù)雜，發(fā)酵條件多樣；葡萄品種、基質(zhì)含糖量、基質(zhì)pH、發(fā)酵溫度等多種非生物因素，結(jié)合基質(zhì)中初始氮源水平，均會對釀酒酵母的生長與發(fā)酵產(chǎn)生影響，但目前相關(guān)研究較少。因此，未來可更加重視基于多因素的酵母發(fā)酵性能影響表現(xiàn)及機制研究，相關(guān)機理的明晰有利于深入挖掘葡萄酒釀酒酵母的發(fā)酵調(diào)控機制，并為葡萄酒生產(chǎn)中的高效氮源管理提供理論支撐。

1.2 氮源添加對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

初始氮含量不足會造成發(fā)酵遲緩甚至停滯，為保證發(fā)酵順利完成需進行氮源補充。發(fā)酵過程中添加YAN可直接影響釀酒酵母生長及酒精發(fā)酵表現(xiàn)（見表1），該影響依添加量、添加類型以及添加時機而異。不同初始氮源類型下，氮添加對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響也有所不同。

研究表明，在發(fā)酵過程的不同時期進行氮添加均可提升發(fā)酵速率，縮短發(fā)酵時間[18]。相比于發(fā)酵中期，在發(fā)酵初期進行氮添加，這一變化更為顯著[9，19]；亦有研究表明，相比在酵母對數(shù)期進行氮添加，接種時添加氮源可提高其最大生長速率[17]。此外，氮添加時機與初始氮源類型可共同影響發(fā)酵速率。對于S.cerevisiaeEC1118，以銨鹽為初始氮源時，相較于發(fā)酵中期，在發(fā)酵初期添加氮源可加快發(fā)酵速率；以氨基酸為初始氮源時，相較于發(fā)酵初期，發(fā)酵中期進行氮添加可促進酵母更快完成發(fā)酵[9]。同時，氮源添加時機對醇酯類物質(zhì)的產(chǎn)量有著不同影響。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵中期進行氮添加更有利于多數(shù)發(fā)酵香氣產(chǎn)量的提高[18-19]，如S.cerevisiaeUCD522和S.cerevisiaePYCC4072，與發(fā)酵初期相比，在發(fā)酵中期進行氮添加，2-苯乙醇、異戊醇和2-乙酸苯乙酯產(chǎn)量更高，而對乙酸異戊酯產(chǎn)量的影響正好相反[9]。對于一些雜醇和乙基酯類物質(zhì)，添加氨基酸和銨混合氮源時雜醇產(chǎn)量下降，僅添加氨基酸時產(chǎn)量升高，添加銨鹽時產(chǎn)量無顯著變化[19]。

在眾多研究中，普遍使用磷酸二氫銨或硫酸銨等銨鹽作為添加氮源，而有研究表明，使用氨基酸混合物作為氮源補充劑相比銨鹽更能有效提高酵母的發(fā)酵速率，對不良揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生也有一定的抑制作用[5]。在進行氮添加時，氮源的選擇對釀酒酵母生長發(fā)酵十分重要，如添加苯丙氨酸和纈氨酸對釀酒酵母的生長有較好的支持作用，而天冬酰胺的添加不利于釀酒酵母的生長，丁醇和丙酸水平相比于添加氨基酸受銨鹽的影響更為顯著[27]?；诓煌磳︶劸平湍赴l(fā)酵表現(xiàn)的影響，可以通過控制氮添加的類型和含量來預(yù)測香氣變化。

針對氮源添加可普遍提升發(fā)酵速率這一現(xiàn)象，MENDESFERREIRA A等[12]對其機理展開深入研究。為研究發(fā)酵中途補充氮源（添加磷酸二氫銨）對于酵母生長發(fā)酵的促進作用，研究者在發(fā)酵72 h后添加磷酸二氫銨，并同時加入胞內(nèi)蛋白質(zhì)從頭合成抑制劑環(huán)己酰亞胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該條件下S.cerevisiaePYCC 4072的整體發(fā)酵速率近似于未做氮添加處理組，由此推斷添加磷酸二氫銨是通過促進酵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)從頭合成來影響釀酒酵母的生長發(fā)酵。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中補充氮源對酵母生物質(zhì)產(chǎn)生和酒精發(fā)酵有直接影響，且酵母生物量增加可提升發(fā)酵速率并縮短發(fā)酵完成時間，但對酵母發(fā)酵副產(chǎn)物積累無顯著影響[28]?；诖?，可初步推測發(fā)酵過程中補充氮源是通過促進酵母生物量積累來影響發(fā)酵速率，然而相關(guān)研究目前多聚焦于探索不同氮源添加條件與酵母菌株差異對于發(fā)酵表現(xiàn)的影響，基于葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中氮源補充對酵母生長、發(fā)酵性能的影響機制研究仍處于初級階段。MENDESFERREIRA A等[12]的研究表明添加氮源（磷酸二氫銨）可促進酵母細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)從頭合成，該研究以單一時間點、單一氮源補充展開，為氮源添加對酵母的影響機制研究開創(chuàng)先河。后期相關(guān)研究可基于酵母生長發(fā)酵不同階段、補充氮源的不同類型，利用同位素示蹤法結(jié)合相關(guān)基因表達分析等手段，對發(fā)酵過程中氮源補充對于酵母生長與發(fā)酵的影響進行全面系統(tǒng)研究。

1.3 氮源與其他非生物因素交互作用對釀酒酵母發(fā)酵和代謝的影響

葡萄醪（汁）作為成分復(fù)雜的發(fā)酵基質(zhì)，其發(fā)酵過程受多因素共同調(diào)控。氮源是其中重要的非生物因素之一，此外，基質(zhì)種類、糖度、酸度、發(fā)酵溫度、其他營養(yǎng)物質(zhì)含量等均為影響酵母生長、發(fā)酵的重要非生物因素。目前，多數(shù)研究致力于解析單一因素對于發(fā)酵的影響，亦有少量研究針對兩個及以上因素的交互影響展開探索。

1.3.1 基質(zhì)含糖量

糖作為酵母最重要的營養(yǎng)物質(zhì)，主要來源于葡萄原料。其為酵母生長提供主要碳源，并參與酵母代謝，直接影響發(fā)酵副產(chǎn)物的生成。碳、氮源共同對酵母生長代謝產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeEC1118的生物量積累隨初始糖濃度的增加而增加，當(dāng)基質(zhì)的含糖量為200 g/L和240 g/L時，該菌株在不同氮源類型下的生物量積累存在差異，在含糖量為280 g/L時，氮源水平升高對酵母生物量積累無顯著促進作用。在含糖量為240 g/L時，相較于單一氮源條件，混合氮源可顯著縮短發(fā)酵時間[26]。目前，研究主要聚焦于糖和氮源對酵母發(fā)酵動力的影響，然而針對酵母代謝產(chǎn)物生成的研究仍存在空白。此外，基質(zhì)含糖量與發(fā)酵環(huán)境中的氮源水平對酵母生長發(fā)酵的交互影響作用及機制值得深入研究，相關(guān)機理的明晰有助于在保證發(fā)酵順利完成的前提下，為葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)的提升提供理論支撐。

1.3.2 發(fā)酵溫度

在葡萄酒發(fā)酵過程中，溫度會對釀酒酵母的生理狀態(tài)、生長代謝及最終葡萄酒成分構(gòu)成產(chǎn)生影響。有研究通過建立葡萄酒發(fā)酵動力學(xué)的物理數(shù)學(xué)模型來探究溫度對發(fā)酵的影響，酵母在不同發(fā)酵溫度（11～35 ℃）、初始含糖量（265～300 g/L）和氮含量（70～350 mg N/L）下進行發(fā)酵，研究表明釀酒酵母在較高發(fā)酵溫度30～35 ℃時未充分吸收利用氮源，并且發(fā)酵溫度過高（30～35 ℃）、氮含量不足（80 mg N/L）會導(dǎo)致發(fā)酵緩慢直至停滯[29]，除此之外，溫度對釀酒酵母的生物量積累以及發(fā)酵性能都有很大影響[30]。因此，在氮缺乏培養(yǎng)基中進行低溫發(fā)酵時，選用低氮耐低溫菌株與釀酒酵母進行種間雜交獲取的雜交菌株，在此條件下發(fā)酵速率與氮源消耗速率均更高，且具有更強的競爭能力，并可高產(chǎn)乙酸酯和高級醇，增加葡萄酒香氣強度和復(fù)雜性[31]。然而，根據(jù)葡萄原料的氮源水平及釀造工藝不同，未來相關(guān)研究可針對不同發(fā)酵溫度與氮源水平的共同影響及作用機理展開。

1.3.3 脂質(zhì)

脂質(zhì)作為酵母的一類生長要素，對酵母能量傳輸、細胞凋亡以及細胞間信息傳遞等具有重要作用，因此在酵母發(fā)酵中扮演著十分重要的角色。研究表明，氮源與植物甾醇對釀酒酵母的影響存在相互作用，可造成酵母的氨基酸代謝能力和發(fā)酵香氣合成動力學(xué)的差異，這種交互影響在高氮條件下更為顯著，同時也具有菌株特異性[32]。此外，發(fā)酵基質(zhì)中脂質(zhì)水平對于酵母氮代謝十分重要。在以麥角甾醇為脂質(zhì)來源的發(fā)酵基質(zhì)中，當(dāng)麥角甾醇含量過低時，高氮水平易導(dǎo)致酵母細胞較高的死亡率[33]。這種交互作用亦發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母發(fā)酵副產(chǎn)物的產(chǎn)生，ROLLERO S等[34]通過研究表明，植物甾醇與氮源可協(xié)同促進釀酒酵母生成異丁醇、異戊醇等發(fā)酵香氣，促進葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)提升。

1.3.4 其他因素

除上述討論的因素外，葡萄品種、基質(zhì)酸度、發(fā)酵環(huán)境氧氣含量等均是葡萄酒發(fā)酵中重要的非生物因素，可對發(fā)酵產(chǎn)生重要影響。在釀酒酵母發(fā)酵過程中，氮源作為重要營養(yǎng)物質(zhì)，為釀酒酵母生長及代謝提供能量與物質(zhì)來源，其缺乏會導(dǎo)致酒精發(fā)酵緩慢甚至停滯。然而，酒精發(fā)酵的順利進行以及優(yōu)良次級代謝物的產(chǎn)生，僅依靠氮源管理無法充分實現(xiàn)；因此研究多種非生物因素對于釀酒酵母生長與發(fā)酵的交互影響尤為重要。目前相關(guān)研究較少，基于三個因素及以上的多因素影響釀酒酵母氮源利用的研究未見報道。后續(xù)相關(guān)研究可基于統(tǒng)計學(xué)模型，以模擬葡萄汁溶液為發(fā)酵基質(zhì)，對包括氮源水平在內(nèi)的多因素交互作用影響展開研究；并利用代謝組學(xué)等技術(shù)，解析釀酒酵母在多因素調(diào)控下的代謝通路，結(jié)合分子手段，明晰不同因素對于釀酒酵母生長發(fā)酵的交互作用機制。

2 氮源對非釀酒酵母生長與發(fā)酵性能的影響

在釀酒酵母與非釀酒酵母的混合發(fā)酵中，非釀酒酵母通過分泌多種胞外酶及自身代謝途徑生成大量揮發(fā)性香氣物質(zhì)，進而影響葡萄酒風(fēng)味[35-36]。葡萄酒中常見的非釀酒酵母主要有假絲酵母（Candida）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora）、梅奇酵母（Metschnikowia）、有孢圓酵母（Torulaspora）和畢赤酵母（Pichia）等。在葡萄酒釀造過程中可以利用非釀酒酵母來改善葡萄酒的風(fēng)味，如水解芳香化合物前體物質(zhì)，合成一些醇酯類物質(zhì)[37]。此外，不同屬種的非釀酒酵母的發(fā)酵特性存在一定差異，對發(fā)酵香氣的貢獻也各有千秋。非釀酒酵母種類繁多，發(fā)酵中的營養(yǎng)利用能力各不相同；發(fā)酵基質(zhì)中以氮源為代表的營養(yǎng)物質(zhì)含量與構(gòu)成可直接影響非釀酒酵母的生長與發(fā)酵，甚至對葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生影響。因此，針對非釀酒酵母氮源利用能力的研究尤為重要。

2.1 初始氮源對非釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

氮源在非釀酒酵母的生長與發(fā)酵過程中扮演了重要角色，且存在明顯的種內(nèi)/種間特異性。有研究表明，氮源含量較高時可加快非釀酒酵母發(fā)酵速率[20]，也有研究發(fā)現(xiàn)，氮源含量對其生長和發(fā)酵速率無顯著影響[14]，但可以縮短發(fā)酵時間[11]。此外，氮源組成也具有重要影響?；旌系矗ò被岷弯@鹽）對有些菌株例如德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）Viniferm和Lachancea thermotolerans2的生物量積累與發(fā)酵速率可產(chǎn)生積極影響，而葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）CECT 1444和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）CECT 13131在純無機氮或純有機氮中有更高的生物量積累及更快的發(fā)酵速率；L.ther motolerans2只有在混合氮源條件下可單獨完成發(fā)酵，也有些菌株比如M.pulcherrimaCECT 13131和Starmerella bacillarisCECT 13129，在任何氮源條件下也無法完成發(fā)酵[25]。研究發(fā)現(xiàn)，Hyphopichia pseudoburtoniiIWBT Y963，Pichia burtoniiIWBT Y951，Zygoascus meyeraeIWBT Y826和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）IWBT等部分菌株的發(fā)酵香氣產(chǎn)量相似，在含有等比例氨基酸與銨的混合氮源條件下，大部分醇類和酯類物質(zhì)的產(chǎn)量都要高于模擬葡萄汁氮源條件下的產(chǎn)量[14]。SEGUINOT P等[15]研究發(fā)現(xiàn)，M.pulcherrimaFlavia和T.delbrueckiiBiodivaTM發(fā)酵香氣的產(chǎn)生取決于氮源的性質(zhì)，以銨為單一氮源時總產(chǎn)量較低，而以蛋氨酸為單一氮源時總產(chǎn)量最高，與S.cerevisiaeEC1118表現(xiàn)一致，這可能與酵母間氮源利用和代謝途徑的相似性有關(guān)。

相較于釀酒酵母，初始氮源的含量及類型對非釀酒酵母生長、發(fā)酵的影響研究仍處于初級階段。然而，隨著非釀酒酵母的廣泛應(yīng)用，全面了解其氮源的吸收利用能力及代謝調(diào)控規(guī)律將有助于混合發(fā)酵的管理。目前該領(lǐng)域研究成果相對較少，且主要聚焦于探索非釀酒酵母在不同初始氮源條件下的發(fā)酵特異性表現(xiàn)，研究方向較為單一。未來相關(guān)研究可基于釀酒酵母現(xiàn)有研究思路與方法，結(jié)合非釀酒酵母種類復(fù)雜性特點；利用組學(xué)技術(shù)，探索歸納基質(zhì)初始氮源對非釀酒酵母生長發(fā)酵的影響，并深入探索相關(guān)機理。

2.2 補充氮源對非釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

發(fā)酵過程中補充氮源對非釀酒酵母發(fā)酵香氣的產(chǎn)生有不同影響。在季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）發(fā)酵過程中，氮添加除可略微提升乙酸乙酯產(chǎn)量外，其他酯類與醇類物質(zhì)產(chǎn)量均無顯著變化或略有減少[11]。而對于葡萄園有孢漢遜酵母（Hanseniasporavineae），2-苯乙醇和2-乙酸苯乙酯的產(chǎn)量隨氮添加稍有增加之后又逐漸下降，在75～100 mg N/L達到最高值，而乙酸苯乙酯和異丁醇的產(chǎn)量在氮添加后有所下降[38]。目前，僅有的相關(guān)研究表明氮添加對非釀酒酵母發(fā)酵的影響較小，且研究的菌株與方向較為單一，無法全面揭示其相關(guān)特性。未來相關(guān)研究可結(jié)合非釀酒酵母種間/內(nèi)差異，針對不同的氮源補充含量和類型以及添加時間，對非釀酒酵母不同發(fā)酵階段的生長與發(fā)酵表現(xiàn)進行全面系統(tǒng)的研究，并解析其相關(guān)作用機理，有助于更好利用非釀酒酵母的發(fā)酵特性。

2.3 混合發(fā)酵中酵母對氮源的競爭作用

由于非釀酒酵母酒精耐受力較低，常被用來與釀酒酵母進行混合發(fā)酵，而釀酒酵母在混合發(fā)酵中對氮源利用存在較強的競爭力[39]。在H.vineaeT02/5A 或M.pulcherrimaM03/26 G與S.cerevisiaeALG804混合發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，若在中期和后期進行氮源補充，可緩解酵母間營養(yǎng)競爭；而在發(fā)酵初期進行氮添加或在任意時間添加較高水平氮源時，釀酒酵母的競爭力占據(jù)主導(dǎo)地位；此外，補充銨鹽可促進M.pulcherrimaM03/26 G的發(fā)酵速率[40]。釀酒酵母與非釀酒酵母進行混合發(fā)酵時可能會出現(xiàn)緩慢發(fā)酵的現(xiàn)象，若及時進行氮源補充，則可促進發(fā)酵順利進行[40]。由于釀酒酵母在發(fā)酵過程中會競爭性取代非釀酒酵母，因此，在混合發(fā)酵中，為保證發(fā)酵平穩(wěn)進行，充分利用非釀酒酵母的發(fā)酵特性，提升葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量，不同酵母間對于氮源等營養(yǎng)物質(zhì)的競爭利用機制值得深入研究。

溫度可影響部分酵母菌株在混合發(fā)酵中的競爭。例如耐低溫的有孢漢遜酵母相比釀酒酵母在低溫下適應(yīng)能力較強，由此削弱了釀酒酵母的競爭力，甚至?xí)〈劸平湍竅41]，該酵母占據(jù)主導(dǎo)會對發(fā)酵進程及最終葡萄酒成分產(chǎn)生不良影響。因此，溫度的調(diào)控對酵母發(fā)酵十分重要，后續(xù)研究可圍繞溫度因素研究不同酵母對氮源的競爭作用，在保證釀酒酵母正常發(fā)酵的情況下，有效發(fā)揮非釀酒酵母的優(yōu)良特性，使其向更利于葡萄酒品質(zhì)的方向發(fā)展。

混合發(fā)酵可減弱非釀酒酵母不良風(fēng)味物質(zhì)的生成量，這與釀酒酵母與非釀酒酵母的接種比例有一定關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)非釀酒酵母的接種比例，可定向調(diào)控乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-苯乙醇、2-甲基-1-丁醇等揮發(fā)性化合物的最終濃度[42]。因此，為促進葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)提升，深化研究結(jié)果的實踐價值，后續(xù)在進行混合發(fā)酵中酵母對氮源等營養(yǎng)物質(zhì)競爭機制的相關(guān)研究時，可結(jié)合不同酵母接種比例進行全面綜合探索。

3 結(jié)語和展望

近年來，非釀酒酵母因其優(yōu)良的發(fā)酵特性而備受關(guān)注，常被用于與釀酒酵母的混合發(fā)酵中，其潛在產(chǎn)香能力可以改善葡萄酒品質(zhì)。因此，在葡萄酒釀造過程中，氮源對于非釀酒酵母產(chǎn)香能力的影響值得更多關(guān)注。此外，非生物因素，例如發(fā)酵溫度、基質(zhì)含糖量、基質(zhì)酸度等對于酵母的氮源吸收與利用亦有影響[5，10]；然而，此類研究仍處于初級階段?；诙嘁蛩氐慕湍傅蠢醚芯考跋嚓P(guān)機制探索可被列入未來研究方向。

氮源對酵母生長和發(fā)酵的影響具有種內(nèi)/種間特異性，為進一步挖掘酵母發(fā)酵特性與共性，深化對酵母種質(zhì)資源的理解與利用，后續(xù)研究應(yīng)重視針對酵母氮源利用與代謝的分子機制探索。同時，作為氮源吸收同化的調(diào)控途徑，氮代謝物阻遏效應(yīng)（nitrogen catabolite repression，NCR）和SPS（Ssy1-Ptr3-Ssy5）機制已在釀酒酵母中被詳盡研究[5，43]。然而，相關(guān)調(diào)控路徑在非釀酒酵母中尚未完全闡明；相關(guān)機理的深入探索對于混合發(fā)酵中酵母間的營養(yǎng)競爭研究具有重要意義。

發(fā)酵終止在葡萄酒釀造中時有發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵終止后，即便及時進行補救，葡萄酒質(zhì)量也會被嚴重影響[44]。氮源缺乏是引起發(fā)酵中止的眾多因素之一，目前普遍解決方式是補充氮源，但由于菌株特異性等原因，補充氮源對酵母生長及發(fā)酵的影響無法完全預(yù)測，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中補充氮源會降低部分發(fā)酵香氣物質(zhì)產(chǎn)量，對葡萄酒質(zhì)量產(chǎn)生負面影響[19]。因此，后續(xù)在針對發(fā)酵過程中補充氮源進行研究時，可結(jié)合氮源與其他釀酒環(huán)境中非生物因素的交互作用，利用多組學(xué)手段，對多因素影響機理進行深入挖掘，并解析混合因素影響下酵母的分子調(diào)控機制。