蠐螬提取物對(duì)脈絡(luò)膜新生血管中趨化因子受體3及其配體嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響

文小娟 蔣鵬飛 彭俊 李建超 周亞莎 彭清華

[摘要]目的觀察蠐螬提取物口服、滴眼兩種給藥途徑對(duì)實(shí)驗(yàn)眼脈絡(luò)膜新生血管（Choroidal neovascularization，CNV）組織的趨化因子受體3（chemokine receptor 3.CCR3）及其配體嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（eOSinophil activated chemotactic factor，Eotaxin）表達(dá)的影響。方法選用8周齡雄性BN大鼠32只，隨機(jī)數(shù)字表法平均分成空白組、模型組、口服組、滴眼組，予以不同干預(yù)措施。采用YAG激光建立CNV大鼠模型，于造模后7、28d行熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）檢查，造模后28d行免疫組化CCR3及其配體Eotaxin染色及其結(jié)果觀察分析。結(jié)果FFA檢查顯示：造模后7d除空白組外，各組均造模成功;造模后28d口服組與滴眼液熒光滲漏減少。CCR3及Eotaxin免疫組化結(jié)果示：口服組與滴眼組CCR3及Eotaxin含量較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;口服組與滴眼組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論蠐螬提取物兩種給藥途徑均可抑制實(shí)驗(yàn)性CNV模型中CCR3及其配體Eotaxin的表達(dá)，從而抑制實(shí)驗(yàn)性CNV的形成。

[關(guān)鍵詞]年齡相關(guān)性黃斑變性;脈絡(luò)膜新生血管;蠐螬提取物;趨化因子受體3;嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

[中圖分類號(hào)]R285.5;R276.7[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.007

年齡相關(guān)性黃斑變性（age related maculat dc-generadon，AMD）是一種發(fā)病率與年齡增長(zhǎng)正相關(guān)的疾病，也是眼科高致盲眼病之一，隨著我國(guó)人口進(jìn)入老年化，AMD發(fā)病人群日漸增長(zhǎng)。滲出型AMD又稱濕性AMD，是AMD的一種類型，特點(diǎn)為病變易發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV），新生血管屬于異常增生血管，脆性大，較正常血管容易破裂出血，對(duì)視力影響較為明顯。本研究通過(guò)建立CNV動(dòng)物模型，觀察了蠐螬提取物口服劑與滴眼液對(duì)實(shí)驗(yàn)性CNV中趨化因子受體3（chemok-inereceptor 3.CCR3）及其配體嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（eosinophil activated chemotactic factor，Eotaxin）的影響，為從中醫(yī)藥角度探索防治滲出性AMD提供思路。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年BN大鼠32只，雄性，體質(zhì)量180-200g，實(shí)驗(yàn)前排除全身性及眼部疾患，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)條件下飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。動(dòng)物由北京微通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：11400700096597。選用8周齡BN大鼠32只，雄性，實(shí)驗(yàn)前行雙眼前節(jié)和眼底檢查未發(fā)現(xiàn)異常改變。將32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法平均分成空白組、模型組、口服組、滴眼組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

參照已有方法制備蠐螬提取物和蠐螬提取物滴眼液;兔抗鼠CCR3單克隆抗體（批號(hào)：Bs-1167R）、兔抗鼠EOTAXINl單克隆抗體（批號(hào)：Bs-1601R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司：羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：GB23303）;PV9000通用型免疫組化染色試劑盒（批號(hào)：K156617J）、DAB濃縮型顯色試劑盒（批號(hào)：K157716A）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

萊特眼底激光治療儀（法國(guó)Quantel公司）、海德堡眼底熒光造影儀（德國(guó)Heidelberg公司）、海德堡光學(xué)相干斷層掃描儀（德國(guó)Heidelberg公司）、裂隙燈顯微鏡（Topcon公司）、ZDS-10型自動(dòng)換擋數(shù)字式照度計(jì)（北京精誠(chéng)華泰儀表有限公司）、RM2235型輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）、YD-A型生物組織攤片機(jī)（上海金迪生物技術(shù)工程有限公司）、MoticBA410研究型顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.4模型制備

參考譚涵宇等的制備方法：模型組、口服組、滴眼組大鼠腹腔內(nèi)注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉藥，按45mg/kg，用復(fù)方托比卡胺滴眼液擴(kuò)瞳。通過(guò)裂隙燈前置鏡，采用532nm倍頻Nd：YAG激光（光斑直徑75Irm，曝光時(shí)間100ms，能量180mW），距視盤約1-1.5PD，在視乳頭周圍擊射視網(wǎng)膜，每眼擊射8-10個(gè)點(diǎn)，避免直接擊射視網(wǎng)膜血管。成功標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)激光光凝后小氣泡產(chǎn)生，并可伴少量出血，表示已經(jīng)擊破BruchS膜。

1.5干預(yù)方法

口服組予以蠐螬提取物，按5.6g/kg蒸餾水稀釋至2mL灌胃，相當(dāng)于成人日用量3倍劑量，1次/日：滴眼組予以蠐螬滴眼液滴眼，4次/d;空白組、模型組、滴眼組蒸餾水2mL灌胃，空白組、模型組、口服組予以玻璃酸鈉滴眼液滴眼，4次/d。造模后第1天分別開始給藥，持續(xù)4周。

1.6 取材與固定

分別于激光后28d觀察期結(jié)束后過(guò)量麻醉處死動(dòng)物，即刻摘除眼球。每只大鼠均選取左眼球于睫狀體扁平部做一小切口，4%福爾馬林固定24h，流水沖洗，將角膜及晶狀體去除后，在距視乳頭顳側(cè)1PD及1.5PD處做垂直于視網(wǎng)膜血管的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜全層取材。將所取標(biāo)本乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡2次，每次30min。石蠟包埋，做4um厚的切片，烘干備用。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H₂O₂室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗，3minx3次。滴加物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10-15min。PBS沖洗，3minx3次。滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10-15min。PBS沖洗，3minx3次。DAB顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗，封片。

1.7 測(cè)試指標(biāo)

1.7.1 行熒光素眼底血管造影（fluoreseein fundus an-giography，F(xiàn)FA）檢查 光凝后7、28d對(duì)模型組、口服組、滴眼組行FFA檢查。BN大鼠腹腔內(nèi)按45mg/kg注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉藥，用0.5%托比卡胺+0.5%鹽酸去氧腎上腺素點(diǎn)眼散瞳。10%熒光素鈉1mL注射后，立即開始攝影，持續(xù)約10min。觀察有無(wú)灌注區(qū)、有無(wú)新生血管。

1.7.2 CCR3及Eotaxin免疫組織化學(xué)檢測(cè) 于400倍目鏡下觀察，每張切片均選取免疫組化陽(yáng)性染色最多的4個(gè)視野框，用Mias-2000圖形分析系統(tǒng)測(cè)定視網(wǎng)膜色素上皮層以下至脈絡(luò)膜間測(cè)量框內(nèi)染成棕黃色的CCR3及Eotaxin的積分光密度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各項(xiàng)指標(biāo)均以“x±s”表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用g檢驗(yàn)（S-N-K法）;非正態(tài)性、方差不齊的計(jì)量資料，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 FFA

造模7d時(shí)，空白組FFA檢查顯示未見明顯異常，模型組、口服組、滴眼組均可見熒光滲漏，見圖1：造模28d時(shí)，空白組無(wú)明顯改變，模型組熒光滲漏明顯增多，口服組、滴眼組熒光滲漏減少，見圖2。

2.2 CCR3及Eotaxin免疫組化

經(jīng)染色后可見視網(wǎng)膜色素上皮層至脈絡(luò)膜之間有CCR3陽(yáng)性表達(dá)?？瞻捉MCCR3陽(yáng)性表達(dá)較少（圖3A），模型組CCR3陽(yáng)性表達(dá)明顯增多（圖3B），且與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）：口服組與滴眼組CCR3陽(yáng)性表達(dá)較模型組均減少（圖3C-D），與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;口服組與滴眼組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。見表1。

空白組Eotaxin在視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較少（圖4A），模型組陽(yáng)性細(xì)胞染色面積及密度明顯增加（圖4B），模型組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）：口服組與滴眼組較模型組的Eotaxin表達(dá)減少（圖4C-D），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），口服組與滴眼組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3討論

西醫(yī)對(duì)AMD多采取激光治療、光動(dòng)力療法等，雖然取得一定療效，但復(fù)發(fā)率高，玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物療效較好，但需多次注射，價(jià)格昂貴。老年黃斑變性在中醫(yī)學(xué)屬于“視瞻昏渺、視直如曲”的范疇。肝腎不足、精血虧虛有關(guān)，若年老體虛，肝腎不足，精血虧虛，黃斑失養(yǎng)則發(fā)生AMD。我們通過(guò)長(zhǎng)期的臨床觀察認(rèn)為，痰瘀互結(jié)是AMD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，提出在補(bǔ)腎明目的基礎(chǔ)上，結(jié)合活血祛瘀、化痰散結(jié)治療AMD。濕性AMD伴有視網(wǎng)膜的水腫、滲出，干性AMD伴有視網(wǎng)膜痰瘀互結(jié)，因此，本病過(guò)程中，始終存在著痰、瘀夾雜的病機(jī)，而蠐螬有破血、行瘀、散結(jié)、解毒、消瘡、明目的功能，契合AMD的病機(jī)，有較好的應(yīng)用前景。

蠐螬早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就作為蟲草類藥材被記載，如“蠐螬，生河內(nèi)平澤及人家積糞草中：取無(wú)時(shí)：反行者良”。隨后歷代醫(yī)書典籍都有相關(guān)記載，如宋朝醫(yī)者陳抃在《陳氏經(jīng)驗(yàn)方》中有“《晉書》吳中書郎盛沖母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開?！薄侗静菥V目》中有蠐螬治療目中青翳白膜的記載。蠐螬性微溫，有毒性，藥用蠐螬為節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱鞘翅目的鰓金龜科Mclolon-thidae、金龜子科Scara-bacidae等金龜總科的幼蟲。具有破血逐瘀、明目退翳的功效，含有豐富的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)、脂肪、外細(xì)胞糖酶，蔗糖酶等多種酶：其藥理作用主要有收縮血管、利尿、抗腫瘤、抗菌、保肝等作用。已有大量文獻(xiàn)表明蠐螬含有大量對(duì)CNV有抑制作用的物質(zhì)，張慶鎬等對(duì)蠐螬礦物元素和維生素含量測(cè)定表明：蠐螬中B族維生素含量較高，維生素A、E的含量也較豐富。而維生素A有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，維生素E有抗氧化作用，這兩種維生素均可抑制CNV發(fā)生時(shí)出現(xiàn)的氧化應(yīng)激損傷。也有研究表明蠐螬提取物中精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸連接而成的短膚鏈對(duì)實(shí)驗(yàn)性CNV有抑制作用。

目前針對(duì)新生血管眼病的研究仍以抗VEGF治療為研究熱點(diǎn)，而新生血管的發(fā)生、發(fā)展涉及多種細(xì)胞因子。本課題組前期已有研究證明：蠐螬提取物可以抑制實(shí)驗(yàn)性家兔CNV中VEGF和bFGF的表達(dá)，減輕NO的過(guò)量生成對(duì)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)細(xì)胞造成的毒性作用，有效保護(hù)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)細(xì)胞。已有研究證實(shí)CCR3及其特異性的配體參與濕性AMD的病理改變，CCR3及其配體在實(shí)驗(yàn)性CNV中出現(xiàn)高表達(dá)，予CCR3拮抗劑干預(yù)后該表達(dá)明顯被抑制，說(shuō)明CCR3信號(hào)在CNV的發(fā)展中有重要的作用。

CCR3是一種趨化因子受體，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族。該基因具有多態(tài)性，位于染色體3p21.3.在嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等均有表達(dá)，既往關(guān)于CCR3的研究方向主要以嗜酸性粒細(xì)胞為主，然而，通過(guò)實(shí)驗(yàn)性鼠CNV標(biāo)本及AMD患者病變部標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CCR3在CNV的表達(dá)過(guò)程中嗜酸性粒細(xì)胞并沒(méi)有改變。該結(jié)果表明CCR3在新生血管中的表達(dá)途徑與在變態(tài)反應(yīng)性疾病不同。已有研究證實(shí)CCR3對(duì)新生血管的發(fā)生主要是與其配體Eotaxin刺激誘導(dǎo)新生血管發(fā)生機(jī)制有關(guān)。CCR3配體包括Eotaxin-1（CCL-11）、Eotaxin-2（CCL-24）和Eotaxin-3（CCL-26）、趨化因子Rants、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-la（MIP-1a）、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-2、MCP-3、MCP-4等，最主要的是CCL類配體。研究表明應(yīng)用CCR3拮抗劑可抑制實(shí)驗(yàn)性CNV模型中CNV的體積。應(yīng)用CCR3中和抗體可使實(shí)驗(yàn)性CNV模型中血管滲漏減少。這些研究同時(shí)證實(shí)了CCR3信號(hào)參與CNV的形成。赫雪飛等研究發(fā)現(xiàn)CCR3能抑制血管發(fā)生，使用CCR3拮抗劑能明顯抑制實(shí)驗(yàn)性角膜新生血管的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性CNV模型組較空白組CCR3及Eotaxin表達(dá)明顯上調(diào)，經(jīng)蠐螬提取物干預(yù)后其表達(dá)均有不同程度降低。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CCR3及Eotaxin的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)性CNV中可明顯增加。同時(shí)表明蠐螬提取物滴眼液與口服劑均能抑制實(shí)驗(yàn)性CNV后CCR3及Eotaxin的表達(dá)，從而抑制了新生血管的發(fā)生和發(fā)展。