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    二氫丹參酮對(duì)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

    2019-09-10 21:27:08陳亮董長(zhǎng)城
    世界中醫(yī)藥 2019年12期
    關(guān)鍵詞:增殖凋亡機(jī)制

    陳亮 董長(zhǎng)城

    摘要?目的:探究二氫丹參酮對(duì)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞,并分為空白組和低/高劑量組,低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理,空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。用CCK-8法檢測(cè)Raji細(xì)胞成活率,Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Raji細(xì)胞凋亡情況,試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Caspase 8活性,免疫熒光法檢測(cè)Raji細(xì)胞中CytC移位情況,蛋白免疫印跡法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果:低/高劑量組藥物干預(yù)24、48 h后細(xì)胞成活率及增殖指數(shù)低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)48 h后,低/高劑量組Raji細(xì)胞凋亡率、Caspase 8活性及CytC表達(dá)量高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較,低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:二氫丹參酮可有效抑制人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,其作用機(jī)制與上調(diào)Caspase8的表達(dá),誘導(dǎo)Bad表達(dá)有關(guān),且呈劑量依賴性。

    關(guān)鍵詞?非霍奇金淋巴瘤;二氫丹參酮;增殖;凋亡;機(jī)制

    Effects of Dihydrotanshinone on Proliferation and Apoptosis of Human Non-Hodgkin′s Lymphoma Raji Cells and its Mechanism

    Chen Liang, Dong Changcheng

    (Steel Hospital of Baotou City, Baotou 014010, China)

    Abstract?Objective:To investigate the effects of dihydrotanshinone on proliferation and apoptosis of human non-Hodgkin lymphoma Raji cells and its mechanism.Methods:Raji cells of human non-Hodgkin′s lymphoma were cultured in vitro and divided into a blank group and a low/high dose experimental group.The experimental group was treated with 8, 15 μmol/L dihydrotanshinone, and the blank group was treated with 0.9% NaCL.CCK-8 method was used to detect the survival rate of Raji cells, and Annexin V-FITC/PI double-staining flow cytometry was used to detect the apoptosis of Raji cells in each group.Caspase 8 activity was detected by kit, and Cytc translocation in Raji cells was detected by immunofluorescence, and Bad and Bax protein expression in Raji cells was detected by Western blotting.Results:The cell viability and proliferation index of low/high dose experimental group were lower than those of the blank group after 24 and 48 hours of drug intervention(P<0.05).After 48 hours of intervention, Raji cell apoptosis rate, Caspase 8 activity and Cytc expression in the low/high dose experimental group were higher than those in the blank group(P<0.05).WB detection showed that compared with the blank group, the expression of Bad protein in the low/high dose experimental group increased(P<0.05), and the expression of Bax protein had no significant difference(P>0.05).Conclusion:Dihydrotanshinone can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of Raji cells in non-Hodgkin′s lymphoma, and its mechanism is related to up-regulation of Caspase 8 expression and Bad expression, and with dose-dependence.

    Key Words?Human non-Hodgkin′s lymphoma; Dihydrotanshinone; Proliferation; Apoptosis; Mechanism

    中圖分類號(hào):R284;R733文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.023

    非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma,NHL)是惡性淋巴瘤(Malignant Lymphoma,ML)的一種,占比達(dá)85%~90%,是一種具有高度侵襲性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,疾病進(jìn)展迅速,較早發(fā)生遠(yuǎn)處擴(kuò)散和結(jié)外侵襲,而單純化療治療效果不佳[1-2]。從中草藥資源中尋找新的活性化合物,提高患者的化療敏感性、改善患者預(yù)后生命質(zhì)量是目前臨床研究的熱點(diǎn)。二氫丹參酮屬于菲醌類脂溶性化合物,其抗菌活性顯著,且近年來(lái)研究報(bào)道,其可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,但與丹參其他生物學(xué)有效成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA等比較,抗腫瘤研究尚處于早期階段,且在NHL方面的抗腫瘤效應(yīng)研究尚不多見(jiàn)[3-4]。本研究重點(diǎn)探討二氫丹參酮對(duì)人NHL Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1?材料與方法

    1.1?材料

    1.1.1?細(xì)胞株?人NHL Raji細(xì)胞,由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院饋贈(zèng)。

    1.1.2?試劑與儀器

    主要試劑:二氫丹參酮(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):YY90060)純度98%;胎牛血清(杭州四季青公司,批號(hào):08040502);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):AE24464298);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20170601);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-8)檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司,批號(hào):BC3880);Bad、Bax抗體(美國(guó)Bioworld公司,批號(hào):AB008、AB009)等。

    主要儀器:SHEL-LAB2300型CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)SHELDON公司產(chǎn)品;LXJ-II型超低溫高速離心機(jī),上海領(lǐng)成生物科技有限公司;IX71型熒光倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;Elx800酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品;DY-A型穩(wěn)壓電泳儀,上海西巴斯公司;JY-ZY5型蛋白凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng),美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品等。

    1.2?方法

    1.2.1?分組與模型制備

    將Raji細(xì)胞采用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d離心換液,進(jìn)行傳代培養(yǎng),取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究[5]。

    1.2.2?給藥方法

    消化細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL,接種于96孔板中,分為空白組和低/高劑量組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理,空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。

    1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

    CCK-8法檢測(cè)Raji細(xì)胞成活率:培養(yǎng)24、48 h后取出96孔培養(yǎng)板,每孔加10 μLCCK-8工作液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,以酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(OD450 nm),計(jì)算細(xì)胞成活率=(組OD平均值/空白組OD平均值)×100%,重復(fù)3次檢測(cè)[6]。

    Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Raji細(xì)胞凋亡情況:于295 μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5 μL,加入10 μL 10 μg/mL的碘化丙啶(PI),4 ℃避光反應(yīng)15 min,加入200 μL 4 ℃緩沖液,應(yīng)用Nex-in程序在guava easy Cyte8微流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)Raji細(xì)胞周期及凋亡率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)[7]。

    Raji細(xì)胞內(nèi)Caspase 8活性檢測(cè):收集作用48 h后的Raji細(xì)胞,裂解細(xì)胞后收集上清。測(cè)定上清中蛋白濃度,采用Caspase-8試劑盒檢測(cè)上清中Caspase-8含量,405 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值。

    免疫熒光法檢測(cè)Raji細(xì)胞中細(xì)胞色素C(CytC)移位情況:取培養(yǎng)于蓋片上生長(zhǎng)融合至95%左右的Raji細(xì)胞,4%甲醛固定,分別經(jīng)DAPI、mitotracker Red CMXRos及綠色熒光標(biāo)記后的CytC抗體孵育染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察Raji細(xì)胞中CytC蛋白移位情況[8]。

    蛋白免疫印跡法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白表達(dá):收集干預(yù)后48 h細(xì)胞,并提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]檢測(cè)方法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白條帶積分吸光度值[9]。

    1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2?結(jié)果

    2.1?各組Raji細(xì)胞形態(tài)及增殖情況比較

    正常組Raji細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,貼壁生長(zhǎng),組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,立體感較差,大量細(xì)胞出現(xiàn)圓縮,間隙增加,可見(jiàn)部分細(xì)胞碎片。干預(yù)24 h后,空白組和低/高劑量組Raji細(xì)胞成活率分別為(99.42±0.13)%,(86.34±4.45)%,(78.56±9.73)%,干預(yù)48 h后,空白組和低/高劑量組Raji細(xì)胞成活率分別為(98.46±0.21)%,(66.47±6.45)%,(48.55±4.43)%,低/高劑量組干預(yù)24、48 h細(xì)胞活率及增殖指數(shù)均低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    2.2?各組Raji細(xì)胞凋亡情況及Caspase-8活性比較

    干預(yù)48 h后,低/高劑量組Raji細(xì)胞凋亡率高于空白組,且高劑量組高于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    2.3?Raji細(xì)胞中Caspase 8活性及細(xì)胞色素C(CytC)表達(dá)情況

    干預(yù)48 h后,低/高劑量組Raji細(xì)胞Caspase 8活性均高于空白組,且高劑量組高于低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。低/高劑量組Raji細(xì)胞CytC表達(dá)量高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

    2.4?各組Raji細(xì)胞Bad、Bax蛋白表達(dá)比較

    與空白組比較,低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bax蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2,表2。

    3?討論

    NHL目前治療策略以化療為主,且與常規(guī)NHL的化療方案比較,高強(qiáng)度、短療程包含CTX、MTX、Ara-c的各種化療方案效果更佳,另外增加利妥昔單抗更有助于進(jìn)一步增強(qiáng)療效;但由于疾病的高度惡性和侵襲性,目前臨床整體治療效果仍不令人滿意[10]。從中醫(yī)學(xué)理論來(lái)說(shuō)NHL起病源于正氣虛損,加之癌毒侵襲,與痰、瘀互結(jié)所致。正氣虛損與腎、脾的關(guān)系密切,腎為先天之本,《諸病源候論》曰:“腎藏精,精者,血之所成也”。脾為后天之本,《景岳全書》曰:“血者水谷之精也,源源而來(lái),生化于脾”。均說(shuō)明了腎、脾與氣血、正氣的密切聯(lián)系;化療藥物屬于攻邪類藥物,此類藥物在“以毒攻毒”的同時(shí)會(huì)損傷陰陽(yáng)氣血及脾、腎等臟,這也是NHL治療中常提到的“攻邪傷正”理論[11-12]。

    丹參是具有活血化瘀、益氣安神、涼血消腫的傳統(tǒng)中藥,二氫丹參酮是丹參的抗腫瘤活性成分之一,近年來(lái)有關(guān)其體外抗腫瘤效應(yīng)日漸突出,可有效抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞A2780[13]、人肝癌細(xì)胞[14]的增殖與轉(zhuǎn)移,但目前有關(guān)二氫丹參酮對(duì)NHL的抗腫瘤效應(yīng)研究尚不多見(jiàn)。本研究結(jié)果證實(shí),與空白組細(xì)胞比較,二氫丹參酮干預(yù)后Raji細(xì)胞成活率及增殖指數(shù)明顯降低,凋亡率明顯升高,證實(shí)二氫丹參酮也具有較好的抑制Raji細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡的作用。外源性凋亡途徑主要由細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo),而內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo),外源性和內(nèi)源性凋亡途徑均可引起胞內(nèi)Caspase-8的活化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。胞內(nèi)酶原形式的pro-caspase 8經(jīng)死亡受體與其相應(yīng)配體結(jié)合后被激活,Bad、Bid、Bim等為Bcl-2家族成員,接受胞內(nèi)死亡信號(hào)后激活,與Bax、Bak作用后導(dǎo)致蛋白寡聚并插入線粒體膜,膜通透性改變導(dǎo)致大量CytC移位并釋放,胞質(zhì)中的Caspase-9前體活化并進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活下游的Caspase-3和Caspase-7,完成底物剪切而引起細(xì)胞凋亡[15]。孫蓓等[16]研究發(fā)現(xiàn),二氫丹參酮通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)、上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用,并誘導(dǎo)其凋亡。Lee等[17]發(fā)現(xiàn),二氫丹參酮作用肝癌HepG2細(xì)胞后,檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)caspase 3、8、9活性增高,Bax表達(dá)上調(diào)。Ishitsuka等[18]用和厚樸酚誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡時(shí),發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)caspase 3、7、8、9活性增高,Bad表達(dá)上調(diào)。

    本研究結(jié)果顯示,干預(yù)48 h后,低/高劑量組Raji細(xì)胞Caspase 8活性及CytC表達(dá)量均高于空白組,與空白組比較,低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)量均升高,Bax蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。提示二氫丹參酮可有效抑制人NHL Raji細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,其作用機(jī)制與上調(diào)Caspase8的表達(dá),誘導(dǎo)Bad表達(dá)有關(guān),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

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    (2019-09-27收稿?責(zé)任編輯:楊覺(jué)雄)

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