復合微生物菌對育肥豬生產(chǎn)性能、胃腸道絨毛及菌群結(jié)構(gòu)的影響

李兆龍 黃宇翔 羅錦義 黃耿光 陳發(fā)亮 黃種杰

摘要：[目的]研究復合微生態(tài)菌劑對育肥豬豬生產(chǎn)性能、胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)及菌群的影響。[方法]選取300頭60日齡25kg的育肥豬，隨機分成對照組和試驗組，試驗組添加微生態(tài)菌劑，對照組添加等量的無菌水。每個處理15個重復，每個重復10頭豬。試驗為期90d，記錄日采食量、日增重，并測定15、30、60、90d的耗料、增重比。試驗結(jié)束時，每處理采集18頭豬的胃黏液和結(jié)腸黏液，運用I11uminaMiSeq方法測定16SrRNA基因并分析，并運用HE染色方法分析育肥豬胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]與對照組相比，添加復合微生物菌處理顯著提高育肥豬的平均日增重35.53g（P<0.05），降低料肉比0.10（P<0.05）;16SrRNA基因測序結(jié)果表明，添加復合微生物菌組的育肥豬胃腸道屬水平乳酸桿菌的豐度（平均67.81%）顯著高于對照組（13.54%）（P<0.05），艱難梭菌屬（4.51%）顯著低于對照（5.55%）（P<0.05）。結(jié)腸黏液屬水平的乳酸菌豐度（平均6.51%）比試驗組高（3.17%）（P<0.05），結(jié)腸黏液屬水平艱難梭菌屬（2.32%）比對照低（3.73%）（P<0.05），艱難梭菌數(shù)量顯著低于對照組（P<0.01）。此外，添加復合微生物菌明顯增加胃腸道絨毛長度和密度（P<0.05）。[結(jié)論]復合微生物菌能夠顯著改善育肥豬的生產(chǎn)性能，增加腸道有益菌，同時改善胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：復合微生物菌;育肥豬;生產(chǎn)性能;16S測序;絨毛

中圖分類號：S 828.5文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1404-07

0 引言

[研究意義]畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素的濫用和超級耐藥菌不斷涌現(xiàn)，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和我國食品安全帶來很大危害。為促進畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和保障食品安全，應用微生物的功能性作用，開發(fā)具有安全高效的復合微生物菌劑，成為當前畜牧業(yè)生產(chǎn)的一種趨勢。而依據(jù)豬的胃腸道微生物功能而開發(fā)的微生物菌劑，在生豬的養(yǎng)殖中應用廣泛。（前人研究進展）有研究證實飼料中添加微生物菌劑飼喂育肥豬，平均日增重可提高6.7%，肉料比可降低11.7%，飼喂微生物添加劑的要比未飼喂的豬每頭節(jié)約飼料成本21.6-27.2元，效果較顯著;也有報道使用芽孢桿菌添加到飼料中，飼喂哺乳仔豬，提高增重22%以上，耗料指數(shù)下降1%～6%，具有較好的經(jīng)濟效益;還有報道證實，添加微生物菌劑，能改善小豬胃腸菌群，可明顯減少哺乳仔豬、仔豬的拉稀，增強機體免疫作用，改善豬舍環(huán)境，減少糞便中有害氣體的產(chǎn)量等。盡管之前的研究證實微生物菌劑不僅能改善斷奶小仔豬的拉稀，還能改善育肥豬的生產(chǎn)性能。但實際生產(chǎn)中的應用還是較少。一方面是因為之前的研究添加菌劑相對單一，對生豬生產(chǎn)性能的改善相對有限，臨床應用也相對有限。另一方面，是因為微生物菌劑功能的發(fā)揮是多菌種相互配合的復雜系統(tǒng)，詳細的作用機理尚待深入揭示，進一步限制了微生物菌劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應用。[本研究切入點]為進一步推動微生物菌劑在生產(chǎn)中的應用，改善生豬的生產(chǎn)性能，本研究采用多菌種的復合菌添加模式，進一步探討復合菌劑對育肥豬的生長、發(fā)育的影響。（擬解決的關(guān)鍵問題）通過運用復合微生物菌（包括芽孢菌、放線菌、乳酸菌、酵母菌、糞腸菌、光合菌等多種菌），進行為期90d的添加飼喂試驗，以期揭示長期添加復合微生物菌對生豬生產(chǎn)性能、胃腸道絨毛和微生物結(jié)構(gòu)影響，從而推動復合微生物菌劑在生豬生產(chǎn)中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物60日齡的杜×長×大育肥豬共300頭購自福建龍巖上杭某養(yǎng)殖公司，體重（25.0±1.6）kg。

1.1.2復合微生物菌本試驗中復合菌華惠一號由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所和泉州華惠生物科技有限公司共同分離培養(yǎng)，包括1.25×10cfu·g以上的芽孢菌、放線菌、乳酸菌、酵母菌、糞腸菌、光合菌等。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗處理設置飼養(yǎng)地點在福建龍巖上杭某養(yǎng)殖公司，采用常規(guī)的水泥面養(yǎng)殖豬舍，平均氣溫22℃，養(yǎng)殖周期90d。育肥豬300頭，隨機分成2組，每組15個重復，每個重復10頭。試驗組飼喂添加復合微生物菌活菌飼料，對照組飼喂常規(guī)的飼料。正式飼喂試驗前7d進行預試驗。飼喂管理按照自由采食方法進行，提供充足清潔飲水，每天進行一次豬舍清掃，定時觀察記錄試驗豬的采食、體重、糞便、精神狀況，常規(guī)疫苗接種。

1.2.2飼料的基礎日糧、營養(yǎng)成分及制備將復合菌液按1：12.5比列添加至玉米粉，在25～38℃密閉發(fā)酵5～7d。試驗組按基礎原料組成配方：發(fā)酵玉米16kg，玉米粉634kg，豆粕280kg，麥麩30kg，預混料40kg進行混勻飼喂。對照組則按基礎原料組成配方：玉米粉650kg，豆粕280kg，麥麩30kg，預混料40kg混勻飼喂。試驗飼料的原料基礎日糧及其營養(yǎng)成分見表1。

1.3 生產(chǎn)性能指標測定

試驗前，對所有豬進行稱重，然后添加復合菌，并分別在15、30、60、90d進行稱重、統(tǒng)計采食量，并計算每頭日均增重、頭均耗料以及耗料增重比，分析復合菌對育肥豬生產(chǎn)性能的影響。1.4腸道絨毛結(jié)構(gòu)測定

飼喂試驗結(jié)束后，各處理分別選擇18頭體重相近且生長狀況良好、未發(fā)生過消化道疾病的育肥豬，空腹處死，取0.25cm的胃、結(jié)腸、盲腸，放入多聚甲醛固定，經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，然后將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中浸蠟、包埋;再將包埋好的組織塊切片，然后脫蠟、至水、染色;染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明;將已透明的切片滴上樹膠，蓋上蓋玻片封固;待樹膠略干后鏡檢。

1.5 16S rRNA基因測序

1.5.1微生物組總DNA提取和目標片段PCR擴增試驗結(jié)束時，通過安樂死處理試驗組和對照組豬（每組10只），分別取處死豬的胃和結(jié)腸黏液進行微生物組總DNA提取，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證提取DNA的純度，同時運用紫外分光光度方法對提取的胃和結(jié)腸黏液DNA進行定量。接著再根據(jù)腸道微生物序列中的保守片段設計引物，對腸道微生物的基因可變區(qū)（單個或連續(xù)的多個）或特定基因片段進行PCR擴增。

1.5.2擴增產(chǎn)物純化和定量PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，回收采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iTPicoGreen dsDNAAssay Kit，定量儀器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。

1.5.3測序文庫制備和高通量測序采用I11umina公司的TmSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒制備測序的基因文庫。將驗證合格的測序文庫進行梯度稀釋，按相應比例混合文庫，混合后再采用堿變性為單鏈進行上機測序;使用MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）和MiSeq測序儀進行2×300bp的雙端測序。

首先進行初步篩查高通量測序的原始下機數(shù)據(jù)的序列質(zhì)量;再按照引物和Barcode信息，將通過質(zhì)量初篩的序列，分配人對應樣本，并去除嵌合體;然后使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對工具，對前述獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。隨后，根據(jù)每個OTU在每個樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件（即OTUtable），該矩陣文件可轉(zhuǎn)換為“BIOM（Biological Observation Matrix）”這一更便于傳輸、儲存并兼容于其他分析工具的文件格式。OTU歸并劃分獲得的序列，然后根據(jù)每個OTU的代表序列進行序列的分類地位鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學分析;接著再根據(jù)OTU在不同樣本中的豐度分布，對每個樣本的多樣性水平進行評估，并根據(jù)樣本的稀疏曲線來評估測序深度;隨后根據(jù)不同分類水平分析各樣本（組）并檢驗組間各自的統(tǒng)計學意義;然后對OTU豐度矩陣中的全體樣本在90%的最低測序深度水平，統(tǒng)一進行隨機重抽樣（即“序列量拉平處理”），從而校正測序深度引起的多樣性差異。隨后，使用QIIME軟件分別對每個樣本計算上述4種多樣性指數(shù)，再通過α和β多變量統(tǒng)計學分析工具，分析不同樣本間及組間的菌群結(jié)構(gòu)差異及與相關(guān)的物種差異;接著根據(jù)微生物腸道菌群的基因測序結(jié)果，預測各樣本的菌群相關(guān)代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合微生物菌劑對育肥豬生產(chǎn)性能的影響

如表2所示，試驗組的育肥豬在15、30、60、90d平均日增重顯著高于對照組，F(xiàn)/G顯著低于對照組。表明在育肥豬日糧中添加復合菌能提高育肥豬日增重，降低料肉比。

2.2 胃腸道結(jié)構(gòu)及絨毛變化

添加復合菌組的豬胃壁縱肌層和橫肌層較厚;胃壁絨毛比對照組長，差異極顯著（P<0.01）;結(jié)腸絨毛和盲腸絨毛比對照組長，差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。此外，對照組的胃壁縱肌層和橫肌層較?。▓D1）。說明復合微生物菌的添加促進了胃腸腸絨毛的發(fā)育，減少了損傷。

2.3 胃和結(jié)腸的微生組成結(jié)構(gòu)

試驗結(jié)束時，各采集18只育肥豬的胃液和結(jié)腸的黏液進行16S rRNA基因測序。結(jié)果如圖2、3所示：試驗組育肥豬的胃黏液屬水平的乳酸菌豐度（平均67.81%）比試驗組高（13.54%）（P<0.05），胃黏液屬水平的艱難梭菌屬（4.51%）比對照低（5.55%），差異顯著（P<0.05）。結(jié)腸黏液屬水平的乳酸菌豐度（平均6.51%）比試驗組高（3.17%），差異顯著（P<0.05），結(jié)腸黏液屬水平艱難梭菌屬（2.32%）比對照低（3.73%），差異顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，在育肥豬日糧中添加復合菌有促進乳酸菌屬豐度、降低艱難梭菌屬豐度的作用。

3 討論

3.1 飼喂復合微生物菌對育肥豬生產(chǎn)性能的影響

育肥豬生產(chǎn)性能的改善，主要體現(xiàn)在日增重增加、耗料增重比的下降等多個方面。本研究結(jié)果表明，飼用復合微生物菌明顯增加日增重，降低耗料增重比，與任瑞蘭等、馬雪花等、何志剛等和文廷富等的試驗結(jié)果較為一致。此外，從15d開始，一直持續(xù)到90d，育肥豬的日增重明顯增加，耗料增重比也明顯降低。本研究中使用的復合菌劑包括了6大類菌，充分考慮到育肥豬胃腸道的不同位置對于微生物菌提供的不同生長條件，胃和十二指腸相對開放，需氧菌多于厭氧菌，而結(jié)腸和盲腸相對密閉，大部分是厭氧菌。之前很多的研究報道，都證實了微生物菌的添加功效，但極少考慮不同位置的胃腸道菌群差異，因此很多研究結(jié)果與實際應用存在一定差異。本試驗充分考慮胃腸道不同位置菌群分布，通過復合菌添加，讓不同菌定植于不同位置，從而保證了外來菌群能夠有效影響內(nèi)在菌群平衡。從研究結(jié)果看，添加復合菌劑的效果確實持續(xù)存在，具體的機理尚待進一步的研究。

3.2 飼喂復合微生物菌對胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)影響

胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，添加微生態(tài)制劑是否能改善生產(chǎn)性能，首要考察其對胃腸道絨毛結(jié)構(gòu)生長是否有促進作用。本試驗比較分析添加復合菌劑組胃、結(jié)腸和盲腸的腸道形態(tài)及絨毛長度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加復合菌組結(jié)腸和盲腸的絨毛比對照組長，與李長軍等、孫媛等用微生態(tài)制劑飼喂仔豬促進豬腸道絨毛發(fā)育，以及歐陽志周通過添加丁酸梭菌可促進豬腸道絨毛發(fā)育的結(jié)果較接近。此外，本次試驗也發(fā)現(xiàn)，飼喂復合微生物菌的育肥豬的胃壁肌層較厚，絨毛長度比對照組長。從胃動力學可知，胃壁肌層厚度越厚，越有利于飼料在胃里的初級消化。而胃的絨毛長度可延長營養(yǎng)物質(zhì)在胃壁的滯留時間，同時也延長微生物在胃壁的作用時間，進一步促進了營養(yǎng)物質(zhì)在胃里的消化吸收，從而對生產(chǎn)性能進行改善。

3.3 飼喂復合微生物菌對育肥豬腸道微生物的影響

育肥豬腸道微生物是宿主營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的關(guān)鍵，對宿主免疫及疾病等起著重要的調(diào)控作用。同時腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)又受到宿主胃腸道內(nèi)環(huán)境以及日糧、品種、外界環(huán)境等的影響。本試驗中添加的復合微生物菌劑，明顯增加胃和結(jié)腸的乳酸菌屬的豐度。胃里的乳酸菌不僅可促進乳糖、蛋白質(zhì)、單糖及鈣、鎂等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生B族維生素等大量有益物質(zhì);同時還可增加腸道有益菌群，改善胃腸道功能，恢復腸道內(nèi)菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護宿主健康;還可抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產(chǎn)生的毒素，清除腸道垃圾等。因此，推測胃、結(jié)腸的乳酸菌屬的豐度增加是改善育肥豬生產(chǎn)性能的重要因素。

此外，本研究也證實，添加復合益生菌可減少艱難梭菌為主的有害梭菌的增殖。有害梭菌的減少可促進菌群平衡，維護腸道結(jié)構(gòu)功能，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而改善生產(chǎn)性能。本試驗和楊紅萍等添加復合微生態(tài)制劑可顯著增加盲腸、結(jié)腸、直腸中乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量以及杜泓明等添加復合益生菌培養(yǎng)物影響斷奶仔豬的盲腸微生物區(qū)系的結(jié)果較為一致。

4 結(jié)論

復合菌劑可增加育肥豬胃、結(jié)腸和盲腸的腸壁絨毛長度，增加胃和結(jié)腸的乳酸菌屬的豐度，同時減少以艱難梭菌為主的有害梭菌的增殖，維護腸道結(jié)構(gòu)功能，保證菌群平衡，促進生產(chǎn)性能的提升，可作為飼料添加劑在生產(chǎn)中應用。