FUCA1基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

李林株 郭靈敏 杜佩銘 黃尚書(shū)

廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院（廣東佛山 528500）

肝細(xì)胞性肝癌（簡(jiǎn)稱肝癌）在世界上腫瘤發(fā)病率中排名第五［1］，每年新發(fā)病例約100萬(wàn)，也是我國(guó)常見(jiàn)的惡性程度最高的腫瘤之一［2］。肝癌的預(yù)后不良主要是因?yàn)槿狈τ行У闹委煼椒ㄒ约斑M(jìn)行根治性切除后仍然有較高的復(fù)發(fā)率［3-5］。目前肝癌的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此，對(duì)肝癌發(fā)病因素的深入探索和新的治療方法的研究具有重要意義。

FUCA1是糖基水解酶29蛋白家族中的一員［6］，它參與糖蛋白、糖脂等生物活性的大分子的分解代謝反應(yīng)，并廣泛分布于人體的組織細(xì)胞、血液和體液中［7］。已有研究表明FUCA1的突變會(huì)導(dǎo)致代謝異常進(jìn)而引起巖藻糖苷貯積癥，但其與癌癥的關(guān)系還不是很明確［8-10］。本研究選擇可手術(shù)肝癌患者為研究對(duì)象，探討FUCA1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，考察其作為臨床侵襲及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 所有標(biāo)本均為廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院普通外科2011年7月至2016年12月具有完整隨訪資料的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者72例。所有患者均知情同意，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 總RNA提取試劑盒（OME?GA，美國(guó)）；qRT?PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，Ta?KaRa，大連）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（RR820A，TaKaRa，大連）；FUCA1抗體和GAPDH抗體（Abcam，美國(guó)）。

1.3 Western blot檢測(cè)FUCA1蛋白表達(dá) 通過(guò)蛋白裂解法收集肝癌組織和癌旁組織蛋白，使用BCA法確保各孔上樣量相等，進(jìn)行垂直電泳，轉(zhuǎn)膜，TBS漂洗，封閉液封閉2 h。加入稀釋的兔抗人FUCA1和GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入二抗，在室溫下1 h后，再TBST洗滌，暗室內(nèi)發(fā)光顯影。

1.4 總RNA的提取和cDNA的合成 根據(jù)OMGA公司提供的總RNA提取試劑盒使用離心柱法提取72例癌與癌旁組織的總RNA。檢測(cè)RNA溶液的濃度和純度A260/A280介于1.8～2.1即可用于逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。將模板RNA按照TakaRa公司qRT?PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明配置為20 μL體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 qRT?PCR測(cè)定FUCA1在癌癥標(biāo)本中mRNA表達(dá) 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，以β?actin為內(nèi)參對(duì)照，反應(yīng)體系為20 μL，根據(jù)試劑盒說(shuō)明配置。FUCA1引物序列為：上游：5′?GAAGC?CAAGTTCGGGGTGTT?3′，下游：5′?GGGTAGTTGT?CGCGCATGA?3′。β?actin 引物序列為：上游：5′?AGAGCCTCGCCTTTGCCCATCC?3′，下游：5′?ATA?CACCCGCTGCTCCGGGTC?3′。

用ABI 7500熒光PCR儀測(cè)定FUCA1的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以β?actin 為內(nèi)參，使用 2?ΔΔCt計(jì)算CT值［11］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用Studentt、χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kaplan?Meier計(jì)算生存曲線，以Log?rank進(jìn)行檢驗(yàn)，使用Cox回歸進(jìn)行單、多因素分析。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUCA1在肝癌組織學(xué)標(biāo)本中高表達(dá) 通過(guò)Western blot和qRT?PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FUCA1在72例肝癌組織中表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)癌旁組織（圖1～3）。

圖1 FUCA1在HCC患者癌與癌旁組織的蛋白水平表達(dá)Fig.1 The FUCA1 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues

圖2 72例肝癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織中FUCA1蛋白表達(dá)量Fig.2 The FUCA1 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues in 72 pateints

圖3 72例肝癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織中FUCA1 mRNA表達(dá)量Fig.3 The FUCA1 mRNA expression in HCC tumor and adjacent normal tissues in 72 pateints

2.2 FUCA1與肝癌的進(jìn)展密切相關(guān) 通過(guò)分析72例患者的病歷資料和后期隨訪資料，聯(lián)系所取標(biāo)本FUCA1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：FUCA1與肝癌的腫瘤大小、血管侵襲、衛(wèi)星灶相關(guān)（P＜0.05，表1）。這表明FUCA1的低表達(dá)與肝癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)而通過(guò)免疫組化（IHC）染色，將72例臨床患者組織根據(jù)FUCA1的表達(dá)量分為兩組：18例為高表達(dá)組，54例為低表達(dá)組。每張IHC染色圖片的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比由3位病理學(xué)家雙盲評(píng)分。染色強(qiáng)度被評(píng)為：0（陰性）、1（陽(yáng)性）、2（強(qiáng)陽(yáng)性）；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分為：0（0%）、1（1% ～25%）、2（26% ～ 50%）、3（51% ～ 75%）、4（76% ～100%）。所得兩組分?jǐn)?shù)相乘即為總分（范圍為0～8），定義小于4分為FUCA1低表達(dá)組，高于4分為FUCA1高表達(dá)組。通過(guò)Kaplan?Meier生存分析，結(jié)果表明FUCA1低表達(dá)組的總體生存率和無(wú)瘤生存率明顯高于FUCA1高表達(dá)組（P＜0.05，圖4、5）。其次，通過(guò)Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：FUCA1表達(dá)量、腫瘤大小、血管侵襲、衛(wèi)星灶以及TNM分期為評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05，表2、3）。

3 討論

癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌患者治療失敗和預(yù)后不良的主要原因，肝癌的進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的包括細(xì)胞蛋白水解、癌癥細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，以及新血管生成的過(guò)程［12-14］。因此研究影響肝細(xì)胞癌預(yù)后的因素對(duì)臨床上治療肝癌具有重要意義。

近年來(lái)有證據(jù)指出隨著結(jié)腸癌的惡化，F(xiàn)U?CA1的表達(dá)逐漸減少［15］，提示FUCA1可能在結(jié)腸癌中表現(xiàn)為抑癌基因的功能。然而FUCA1在肝癌中的表達(dá)和其與肝癌的預(yù)后關(guān)系還不得而知。本研究發(fā)現(xiàn)FUCA1相對(duì)于肝癌組織，在癌旁組織的蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯增高。FUCA1的表達(dá)與腫瘤大小、血管侵襲、衛(wèi)星灶密切相關(guān)。Kaplan Meier生存分析顯示，相對(duì)于高表達(dá)，F(xiàn)UCA1低表達(dá)的肝癌患者總體生存率和無(wú)瘤生存率均明顯下降，說(shuō)明FUCA1表達(dá)下調(diào)是不良的預(yù)后因子。同時(shí)，Cox回歸多因素分析提示，F(xiàn)UCA1表達(dá)、腫瘤大小、血管侵襲、衛(wèi)星灶以及TNM分期為評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，在肝癌中，F(xiàn)UCA1的表達(dá)水平與腫瘤大小、血管侵襲、衛(wèi)星灶以及TNM分期一樣，可作為潛在的預(yù)后因子。

本研究發(fā)現(xiàn)單因素分析中腫瘤大小對(duì)應(yīng)總體生存率和無(wú)瘤生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在多因素回歸分析中腫瘤大小是評(píng)價(jià)患者預(yù)后的主要獨(dú)立因素之一。推測(cè)腫瘤大小可能與其他危險(xiǎn)因素具有一定的協(xié)同作用從而導(dǎo)致此類情況或存在病例選擇偏倚有關(guān)。

圖4 FUCA1表達(dá)與總體生存率Fig.4 The expression of FUCA1 and the overall survival

表1 FUCA1表達(dá)水平與肝癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Tab.1 Correlation between the expression of FUCA1 in 72 HCC tissues and their clinicopathological characteristics 例

圖5 FUCA1表達(dá)與無(wú)瘤生存率Fig.5 The expression of FUCA1 and the disease free survival

表2 肝細(xì)胞肝癌臨床病理指標(biāo)單因素生存分析Tab.2 Univariate survival analysis of OS and DFS in 72 patients with HCC

表3 肝細(xì)胞肝癌臨床病理指標(biāo)多因素生存分析Tab.3 Variate survival analysis of OS and DFS in 72 patients with HCC

綜上所述，本研究首次證實(shí)了FUCA1在原發(fā)性肝癌中呈低表達(dá)，可作為腫瘤侵襲潛能的預(yù)測(cè)指標(biāo)。FUCA1高表達(dá)伴隨著肝癌更高的生存率，是潛在的預(yù)后因子，將可能為基因治療原發(fā)性肝癌提供有效的靶點(diǎn)和途徑。

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