黃連堿對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA基因的表達(dá)的影響

陳建武 王曉娟

·論著·

黃連堿對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA基因的表達(dá)的影響

陳建武 王曉娟

目的觀察黃連堿對(duì)Sprague Dawley大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA基因表達(dá)的影響，探討其治療骨關(guān)節(jié)炎的作用及可能機(jī)制。方法取SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨，剪碎后，采用酶消化法原代分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代細(xì)胞隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組加入含10 μm黃連堿的培養(yǎng)基，對(duì)照組僅加入普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)黃連堿在1，3，5，7天對(duì)軟骨細(xì)胞增殖影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)培養(yǎng)7天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA表達(dá)。結(jié)果培養(yǎng)48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)密集程度明顯優(yōu)于對(duì)照組；MTT檢測(cè)也顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況優(yōu)于對(duì)照組；培養(yǎng)7天后實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組。結(jié)論黃連堿能促大鼠軟骨細(xì)胞增殖，并提高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA的表達(dá)，提示這可能是其治療骨關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制之一。

黃連堿； 軟骨細(xì)胞； 增殖； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床最常見的關(guān)節(jié)疾病之一，其最主要的病理性改變是進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退變，從而導(dǎo)致周圍骨質(zhì)和關(guān)節(jié)滑膜發(fā)生病理改變，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展到終末期會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形而喪失功能[1]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞成分，各種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)著軟骨細(xì)胞的增殖、分化及代謝，并始終貫穿于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的過(guò)程中，目前國(guó)外研究已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta 1， TGF-β1)在軟骨細(xì)胞修復(fù)中起著重要的作用[2]。中藥黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch的干燥根莖，中醫(yī)認(rèn)為長(zhǎng)期應(yīng)用具有清熱、燥濕、解毒、瀉火的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃連具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病等作用，黃連堿是黃連主要活性成分之一[3]。目前關(guān)于黃連堿對(duì)軟骨細(xì)胞增殖影響的研究報(bào)道較少。本研究采用體外軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，觀察黃連堿對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)情況，初步探討其治療骨關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

本研究采用的清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠購(gòu)置于蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國(guó))；0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶、青鏈霉素混合液(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(FBS)(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；黃連堿(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST10030711)；PBS(索萊寶生物科技有限公司)；TGF-β1及GAPDH引物均購(gòu)自上海生物工程有限公司；TRIzol(Invitogen公司，加利福尼亞，美國(guó))；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO Life Science，東京，日本)；SYBR Green Realtime PCR master Mix-Plus(TOYOBO Life Science，東京，日本)。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào) DH-801 上海三騰儀器有限公司，上海，中國(guó))；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào) RJ17DG5033A 中西集團(tuán)，遼寧沈陽(yáng)，中國(guó))；紫外分光光度計(jì)(Beckman DU530 Germany)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems Company, Carlsbad, USA)；潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司，東京，日本)。

1.3 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

脫頸處死SD大鼠后，碘酊、75%乙醇消毒、鋪巾，正中切口切開膝關(guān)節(jié)，用無(wú)菌刀片切取股骨髁、滑車及髕骨表面的關(guān)節(jié)軟骨并置于含雙抗的PBS緩沖液無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加蓋移入超凈工作臺(tái)，首先用含有雙抗的PBS緩沖液反復(fù)漂洗組織3次，采用無(wú)菌手術(shù)器械去除黏附于軟骨周圍的血液及組織。將沖洗清理干凈的軟骨用眼科剪剪碎并置入無(wú)菌瓶中，依次加入0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型酶，在磁力攪拌條件下消化，待無(wú)明顯的軟骨組織塊時(shí)終止消化，取消化液置于離心管于1500 r/min離心8分鐘，棄上清，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基4 ml重懸細(xì)胞，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，靜置于恒溫37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔三天更換1次培養(yǎng)液，按時(shí)在倒置顯微鏡下觀察、拍照，當(dāng)細(xì)胞增殖至瓶底80%左右時(shí)按適當(dāng)比例傳代培養(yǎng)。

1.4 分組

實(shí)驗(yàn)組為10 μm黃連堿與P3代大鼠軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)；對(duì)照組為P3代大鼠軟骨細(xì)胞普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài) 實(shí)驗(yàn)組為含黃連堿(10 μm)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液與大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(P3代)5×104在六孔板中共培養(yǎng)，對(duì)照組將大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞5×104在含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的六孔板中培養(yǎng)。在37℃飽和濕度及5%二氧化碳細(xì)胞孵育箱中分別進(jìn)行共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5.2 MTT檢測(cè) 取形態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3代軟骨細(xì)胞，常規(guī)采用胰酶消化離心后，用含10%胎小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將消化后獲得的細(xì)胞稀釋并計(jì)數(shù)成2.5×106/L后，接種于96孔板中每孔200 μl，培養(yǎng)條件與既往培養(yǎng)條件一致。分別在第1、3、5、7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5個(gè)孔，每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS 配)20 μl。孵育4小時(shí)后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞離心后再吸棄培養(yǎng)上清液。分別在孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm并記錄結(jié)果[4]。

1.5.3 軟骨細(xì)胞TGF-β1 mRNA檢測(cè) 將培養(yǎng)7天后的細(xì)胞用胰酶消化后離心收集。移入勻漿器中并加入1 ml Trizol，充分研磨后靜置15分鐘，經(jīng)氯仿萃取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌后加入30 μl DEPC 水溶解提取總RNA，用分光光度儀檢測(cè)RNA純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過(guò)程均按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60秒，采用三步法測(cè)定：95℃ 15秒，57℃30秒，72℃ 45秒共計(jì)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。TGF-β1引物: 上游引物序列為5’-TTC TCC ACC AAC TAC TGC TTC-3’，下游引物序列為5’-GGT GTC CAG GCT CCA GAT-3’。采用GAPDH作為內(nèi)參照，根據(jù)熒光定量PCR儀顯示的CT值結(jié)果，以對(duì)照組做參照通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算RQ值并統(tǒng)計(jì)分析兩組的相對(duì)基因表達(dá)差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，倒置顯微鏡100倍顯微視野下觀察，兩組培養(yǎng)細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)污染及支原體感染跡象，黃連堿共培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞密集程度明顯高于對(duì)照組且形態(tài)良好，見圖1。

圖1 體外培養(yǎng)48小時(shí)后軟骨細(xì)胞形態(tài)

2.2 MTT測(cè)定結(jié)果

兩組細(xì)胞在體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第1、3、5、7天均呈明顯上升趨勢(shì)，細(xì)胞生長(zhǎng)第1天兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組于第3、5、7天均高于對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明與一定濃度的黃連堿共培養(yǎng)液能夠促進(jìn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞促增殖,見表1。

表1 軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)MTT檢測(cè)結(jié)果

注：同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比aP<0.05

2.3 qRT-PCR結(jié)果

提取RNA并稀釋100倍后用分光光度儀檢測(cè)吸收波長(zhǎng)在A260及A280的OD值，求得各樣本的A260/A280比值在1.8～2.0之間，說(shuō)明提取的RNA純度較高。據(jù)A260的OD值計(jì)算得RNA濃度。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增后行熒光定量，獲得CT值，計(jì)算RQ值。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組TGF-β1 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 軟骨細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

依據(jù)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)等疾病特點(diǎn)，中醫(yī)將其歸入“痹證”范疇?！吨T病源候論·風(fēng)痹證》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹，其狀肌肉頑厚或疼痛。”《黃帝內(nèi)經(jīng)》對(duì)痹癥也進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，認(rèn)為風(fēng)、寒、濕邪氣侵襲機(jī)體、經(jīng)絡(luò)、臟腑，閉阻不散，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵直?？梢婏L(fēng)寒濕邪在痹證發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的起著至關(guān)重要的作用。大量臨床報(bào)道采用中醫(yī)藥方法治療本病亦多從祛風(fēng)濕、止痹痛著手，且取得一定的療效。而臨床常用的痹證驗(yàn)方干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)從多方面證實(shí)祛風(fēng)濕、止痹痛治法的有效性[5]。黃連堿是屬于異喹啉生物堿，這類生物堿主要包括小檗堿、黃藤素、表小檗堿和木蘭堿等[6]。這類生物堿具有多種生物學(xué)活性，如抗糖尿病、抗炎和抗氧化的作用[7-9]。目前多數(shù)研究都關(guān)注于小檗堿的抑制骨吸收作用[10]。藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)口服黃連堿也具有其生物學(xué)活性[11-12]。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃連堿能夠有效抑制RANKL介導(dǎo)的NFATc1基因的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的增殖和其骨吸收的活性[13]?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)與小檗堿和黃藤素相比，對(duì)黃連堿的研究相對(duì)較少，因此在本研究中研究了黃連堿對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。

TGF-β1是一類具有多種功能的細(xì)胞因子，廣泛存在在動(dòng)物的正常組織細(xì)胞內(nèi)，其中以骨組織中和血小板中的含量最顯著。目前研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1是目前多種調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子中作用最強(qiáng)的，在關(guān)節(jié)軟骨的生長(zhǎng)和修復(fù)中起了關(guān)鍵的作用。一方面，TGF-β1具有向軟骨分化的誘導(dǎo)作用，其可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞像軟骨細(xì)胞分化。另一方面，TGF-β1具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用。其可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖，這兩種細(xì)胞外基質(zhì)是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)，采用含有黃連堿的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞能夠顯著的增加軟骨細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，從而增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。然而這種促進(jìn)軟骨細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的機(jī)制是否存在劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系還需要在進(jìn)一步的研究中證實(shí)。除此以外，還有相關(guān)研究證實(shí)，TGF-β1的表達(dá)增加能夠顯著抑制人軟骨細(xì)胞金屬蛋白酶1mRNA基因的表達(dá)，刺激人軟骨細(xì)胞金屬蛋白酶1組織抑制劑mRNA基因表達(dá)，金屬蛋白酶1表達(dá)的增高與人骨關(guān)節(jié)炎的形成具有密切關(guān)系。另外有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以顯著抑制軟骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是通過(guò)TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)細(xì)胞膜上的TGF-β受體Ⅰ和TGF-β受體Ⅱ共同參與，并通過(guò)受體下游信號(hào)分子Smad家族實(shí)現(xiàn)的，Smad家族中Smad2和Smad3可抑制軟骨細(xì)胞的成熟過(guò)程，實(shí)際上亦即TGF-β1可以阻止軟骨細(xì)胞向成熟方向分化，進(jìn)而阻止其凋亡發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃連堿能夠在體外有效維持關(guān)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)并且促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，能夠顯著提高關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的TGF-β1的表達(dá)。這可能是其治療骨關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制之一。然而，黃連堿是通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化和TGF-β1的表達(dá)還需要進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯：秦楠)

EffectofcoptisineonproliferationofratarticularchondrocytesculturedinvitroandmRNAexpressionoftransforminggrowthfactor-beta1

CHENJian-wu,WANGXiao-juan.

MedicalDivisionofXinjiangmilitaryregion,Urumqi830042,China

Correspongdingauthor:WANGXiao-juan,E-mail：wangxiaojuan491@126.com

ObjectiveTo observe the effect of coptisine on the proliferation of rat articularchondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and then to explore the role and possible mechanism of coptisine in the treatment of osteoarthritis.MethodsKnee cartilage was shredded after harvested from SD rats under sterile conditions, and chondrocytes were isolated and cultured by the way of enzymatic digestion. After identifying by toluidine blue staining, the third-passage cells in the logarithmic growth phase were cultured in vitro and randomly divided into two groups after adherence. The experimental groups were cultured in DMEM with 10 μm coptisine, while the control group was given with normal medium alone. Chondrocytes morphology was observed under an microscope after 48 hours. 1, 3, 5, 7 days later, Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) assay method was adopted to observe the influence of coptisine on the proliferation of chondrocytes.Transforming growth factor-β1 mRNA levels were detected and analysed by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR) at 7days after cell culture.ResultsThe cell growth intensity in the co-culture group was significantly better than in the control group observed under microscopeafter 48 hours after culture. MTT assay showed that cell proliferation in experimental group were higher than in the control group after 3 days of cell culture.transforming growth factor-β1 mRNA level in the co-culture group weresignificantly better than the control group after 7 days of cell culture.Conclusioncoptisine can promote proliferation of chondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and these may be one of the possible mechanisms thatcoptisine can work in the treatment of osteoarthritis.

Coptisine； Chondrocyte； Proliferation； Transforming growth factor-β1

830042 烏魯木齊，新疆軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生處(陳建武)；解放軍第23醫(yī)院藥械科(王曉娟)

陳建武(1974- )，本科，主治醫(yī)師。研究方向：衛(wèi)生事業(yè)管理。E-mail: chenjianwu491@126.com

王曉娟(1972- )，女，本科，主管藥師。研究方向：藥理研究及臨床應(yīng)用。E-mail: wangxiaojuan491@126.com

R285.6

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.04.004

2014-01-18)