一測多評法同時測定咽炎片中5種指標性成分的含量

馬昌豪　李懷偉　仝桂平　馬海春　馮思騰

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2232-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.14

摘 要 目的：建立一測多評法同時測定咽炎片中芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸等5種指標性成分的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil GOLD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.35%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為280 nm（蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸）、230 nm（芍藥苷），柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。以芍藥苷為內(nèi)參物，建立蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的相對校正因子;考察不同色譜系統(tǒng)、色譜柱、流動相比例、流速、柱溫對相對校正因子的影響，并按相對保留時間對待測成分進行色譜峰定位。按外標法測定內(nèi)參物芍藥苷含量，按一測多評法測定其余4種成分含量，并與外標法測定結(jié)果進行比較。結(jié)果：各待測成分的分離度均大于1.5;芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的質(zhì)量濃度分別在3.97～119.22、1.96～58.68、2.39～71.64、1.92～57.51、0.54～16.24 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 7）;精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率為97.20%～98.07%（RSD<3%，n=6）。以芍藥苷為內(nèi)參物，蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的平均相對校正因子分別為0.554 6、1.815 6、2.489 3、5.423 2;在不同色譜條件下其相對校正因子和相對保留時間的RSD均小于5%。采用一測多評法與外標法分別測得10批咽炎片待檢樣品中4種成分（除內(nèi)參物外）含量的相對誤差絕對值均小于1%，兩種方法測定結(jié)果一致。結(jié)論：本方法準確、快捷、高效、價廉，可用于同時測定咽炎片中5種指標性成分的含量。

關(guān)鍵詞 咽炎片;一測多評法;芍藥苷;蘆丁;木蝴蝶苷B;黃芩苷;肉桂酸;高效液相色譜法;含量測定

Simultaneous Determination of the Contents of 5 Indicator Components in Yanyan Tablets by QAMS

MA Changhao， LI Huaiwei， TONG Guiping， MA Haichun， FENG Siteng （Heze Institute for Food and Drug Control， Shandong Heze 274000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish QAMS method for content determination of paeoniflorin， rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates in Yanyan tablets. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Hypersil GOLD-C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） with mobile phase consisted of methanol-0.35% phosphoric acid solution （gradient elution） at flow rate of 1 mL/min. The detection wavelengths were set at 280 nm （rutin， oroxin B， baicalin， cinnamates） and 230 nm （paeoniflorin）. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. Using paeoniflorin as internal reference， relative correction factors （RCF） of rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates were established. Effects of different chromatogram system， chromatogram column， mobile phase proportion， flow rate and column temperature on relative correction factors were investigated; the chromatographic peaks of the components were located according to the relative retention time. The content of paeoniflorin as internal reference was determined by external standard method， and the other four components were determined by QAMS， and then compared with the results of external standard method. RESULTS： The separation degree of each component to be measured was greater than 1.5. The linear range was 3.97-119.22 μg/mL for paeoniflorin，1.96-58.68 μg/mL for rutin，2.39-71.64 μg/mL for oroxin B， 1.92-57.51 μg/mL for baicalin， 0.54-16.24 μg/mL for cinnamates（r≥0.999 7）， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 2%. Average recoveries were 97.20%-98.07%（RSD<3%，n=6）. RCFs of rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates were 0.554 6，1.815 6，2.489 3 and 5.423 2， using paeoniflorin as internal reference. RSDs of RCF and relative retention time were all lower than 5% under different chromatogram conditions. Absolut relative error of four components （except for internal reference） in 10 batches of Yanyan tablets sampled by QAMS and external standard method were all less than 1%. The results of the two methods were identical. CONCLUSIONS： The established method is accurate， rapid， efficient and inexpensive， and it can be used for simultaneous determination of 5 indicator components in Yanyan tablet.

KEY WORDS? ?Yanyan tablet; QAMS; Paeoniflorin; Rutin; Oroxin B; Baicalin; Cinnamates; HPLC; Content determination

咽炎片是由玄參、款冬花（制）、牡丹皮、木蝴蝶、地黃等12味藥材組方而成的口服片劑，具有養(yǎng)陰潤肺、清熱解毒、清咽利喉、鎮(zhèn)咳止癢等作用，臨床上用于治療慢性咽炎引起的咽干、咽癢、刺激性咳嗽等[1]。該制劑配伍藥材中，玄參清熱涼血、滋陰降火，為主藥;牡丹皮清熱涼血，木蝴蝶清熱利咽，款冬花潤肺下氣、止咳化痰，共為臣藥。已有研究分別對咽炎片中芍藥苷、黃芩苷、蘆丁、木蝴蝶苷B等成分進行含量測定[2-5]，但由于多種成分同時測定所需的對照品較多，而部分對照品價格高昂，導致檢驗成本較高。一測多評法（Quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是指以樣品中某一個典型組分為內(nèi)參物，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子，再通過相對校正因子計算其他組分含量的方法[6-7]，可較好地解決多種成分同時測定時對照品消耗多、檢驗成本高的問題。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種藥材和制劑的質(zhì)量控制[8-13]，且2015年版《中國藥典》（一部）[14]也已收載該方法。基于此，結(jié)合咽炎片組方特點，以牡丹皮中的芍藥苷，款冬花中的蘆丁，木蝴蝶中的木蝴蝶苷B、黃芩苷和玄參中的肉桂酸為指標性成分，采用QAMS法同時測定咽炎片中上述5種成分的含量，為進一步完善咽炎片的質(zhì)量標準及有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀、1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;LC-2030型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;XS-105型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Milli-Q型超純水機（德國Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號：110736-201842，純度：97.4%）、蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：91.7%）、木蝴蝶苷B對照品（批號：111915-201603，純度：91.9%）、黃芩苷對照品（批號：111715-201720，純度：93.5%）、肉桂酸對照品（批號：110786-201604，純度：98.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇（色譜純，德國艾普力公司）;磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）;水為超純水。

咽炎片標準樣品（編號：S1）由本課題組按照該制劑處方工藝自制;10批咽炎片待檢樣品來自山東省藥品風險質(zhì)量監(jiān)測抽檢廠家，樣品信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5? ? μm）;流動相：甲醇（A）-0.35%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，30%A;25～50 min，30%A→43%A;50～70 min，43%A→45%A;70～85 min，45%A→30%A）;檢測波長：280 nm（蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸）、230 nm（芍藥苷）;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸各對照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，制成上述5種成分質(zhì)量濃度分別為0.198 7、0.097 8、0.238 8、0.191 7、0.108 3 mg/mL的單一對照品貯備液;精密量取上述各貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成上述5種成分質(zhì)量濃度分別為39.74、19.56、23.88、19.17、5.42 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細，混勻;取藥粉約4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，冷卻至室溫，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 參照咽炎片處方配料比，制備同時缺少牡丹皮、款冬花、木蝴蝶、玄參的陰性對照樣品。取該樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號：S1）和陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，理論板數(shù)按黃芩苷和木蝴蝶苷B峰計均不低于5 000，各色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對照溶液對測定無干擾，色譜圖詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下黃芩苷對照品貯備液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL，蘆丁對照品貯備液0.20、0.60、1.00、2.00、4.00、6.00 mL，木蝴蝶苷B對照品貯備液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL，芍藥苷對照品貯備液0.20、0.60、1.00、2.00、4.00、6.00 mL，肉桂酸對照品貯備液0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、1.50 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成單一對照品的系列線性溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果表明各待測成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，詳見表2。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸峰面積的RSD分別為0.68%、0.84%、0.23%、1.62%、0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取自制咽炎片標準樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算各待測成分的含量。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸含量的RSD分別為1.21%、0.56%、0.39%、1.01%、0.98%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，于室溫下密封放置0、8、16、24、48 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸峰面積的RSD分別為1.13%、1.27%、1.36%、0.82%、1.07%（n=5），表明供試品溶液在上述條件下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的自制咽炎片標準樣品（編號：S1，含芍藥苷0.113 2 mg/g、蘆丁0.205 1 mg/g、木蝴蝶苷B 0.358 7 mg/g、黃芩苷0.092 4 mg/g、肉桂酸0.141 0 mg/g）細粉2.0 g，精密稱定，混勻，置于具塞錐形瓶中，平行操作6份。各份樣品均分別加入“2.2.1”項下各單一對照品貯備液（芍藥苷貯備液1.00 mL、蘆丁貯備液4.00 mL、木蝴蝶苷B貯備液 3.00 mL、黃芩苷貯備液1.00 mL、肉桂酸貯備液2.00 mL），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算各待測成分含量并計算加樣回收率。結(jié)果，各待測成分平均加樣回收率為97.20%～98.07%（RSD為0.76%～2.03%，n=6），表明方法準確度良好，詳見表3。

2.9 相對校正因子的計算及驗證

2.9.1 相對校正因子的計算 以芍藥苷為內(nèi)參物，取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣不同體積進行測定，計算相對校正因子（fk/s），并取其平均值用于QAMS法定量分析。相對校正因子計算公式：fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As），式中Ws為內(nèi)參物進樣量，As為內(nèi)參物峰面積，Wk為成分k的進樣量，Ak為成分k的峰面積。內(nèi)參物芍藥苷（a）的含量采用外標法計算，其他4種成分即蘆丁（b）、木蝴蝶苷B（c）、黃芩苷（d）、肉桂酸（e）的含量則采用各自與內(nèi)參物的fk/s進行計算。各待測成分相對校正因子計算結(jié)果見表4（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對校正因子略去）。

2.9.2 相對校正因子的重現(xiàn)性考察 在一定范圍內(nèi)改變流動相比例、流速、柱溫，考察分析條件的變化對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示，流動相比例、流速和柱溫在±5%范圍內(nèi)變化時各待測成分的相對校正因子的RSD均小于5%，表明其對各待測成分相對校正因子的影響較小。同時，分別采用不同品牌的色譜系統(tǒng)（Agilent 1260、Agilent 1200、Shimadzu LC-2030）和色譜柱[Hypersil GOLD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，考察其對相對校正因子的影響，結(jié)果各待測成分的相對校正因子的RSD均小于5%，表明在不同色譜系統(tǒng)和色譜柱條件下各待測成分相對校正因子具有良好的重現(xiàn)性，詳見表5（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對校正因子略去）。

2.9.3 待測成分色譜峰定位 色譜峰的準確定位一般采用相對保留時間，同時結(jié)合色譜圖整體特征和特征峰的紫外吸收來定位待測成分色譜峰[6]。本研究以芍藥苷為內(nèi)參物，參照“2.1”項下色譜條件，在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱條件下考察其余各待測成分的相對保留時間的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸與內(nèi)參物芍藥苷的相對保留時間的RSD均小于5%。這表明在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱條件下各待測成分的相對保留時間重現(xiàn)性良好，詳見表6（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對保留時間略去）。

2.10 QAMS法測定咽炎片中5種指標性成分含量及其與外標法測定結(jié)果的比較

分別采用外標法測定10批咽炎片中芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的含量;同時，以芍藥苷為內(nèi)參物，采用QAMS法對其他4種成分進行定量分析。以相對誤差[RE，計算公式：RE=（QAMS法測得含量-外標法測得含量）/外標法測得含量×100%]對兩種方法測定結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，兩種方法測得含量的RE絕對值均小于1%，表明其測定結(jié)果一致，詳見表7（注：內(nèi)參物芍藥苷的兩種方法測定結(jié)果數(shù)據(jù)相同）。

3 討論

本研究前期考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液等流動相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明甲醇-0.35%磷酸水溶液對5種待測成分的分離效果最佳、分析時間也較短，故確定甲醇-0.35%磷酸水溶液為流動相。此外，分別對5種待測成分在190～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收情況進行考察，結(jié)果顯示芍藥苷在230 nm波長處有吸收峰，木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸在280 nm波長處有吸收峰，蘆丁在258、354 nm波長處均有吸收且在280 nm波長處有較強吸收，綜合考慮后，選擇230 nm作為芍藥苷的檢測波長，280 nm作為其余4種成分的檢測波長。在本研究色譜條件下，咽炎片中5種指標性成分的出峰順序分別為芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸。根據(jù)相關(guān)文獻對內(nèi)參物選擇的要求[6]，芍藥苷出峰附近干擾成分少、出峰時間快、廉價易得，故選擇其作為內(nèi)參物。

中藥制劑組成復雜、作用機制不易明確的特性使其質(zhì)量控制存在諸多困難，通過單一指標性成分難以全面評價藥品整體質(zhì)量[15]，因此多指標測定有利于更好地反映中藥制劑的質(zhì)量水平。但采用常規(guī)的外標法或者內(nèi)標法進行多指標測定時，存在對照品難以全部獲取或價格昂貴、操作較繁瑣，檢驗時間更長、成本高昂等問題。而QAMS法可根據(jù)中藥制劑中各成分間的相應(yīng)比例，通過僅測定一個成分的含量，從而實現(xiàn)多個成分同步測定，克服了常規(guī)方法的弊端。本研究建立了同時測定咽炎片中5種指標性成分的QAMS法，并將其測定結(jié)果與常規(guī)外標法測定結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，QAMS法與外標法測定結(jié)果一致，RE絕對值均小于1%，且在不同測定條件下各待測成分相對校正因子和相對保留時間的重現(xiàn)性均良好。

綜上所述，本研究所建方法準確、快捷、高效、價廉，可用于同時測定咽炎片中5種指標性成分的含量，并可推廣用于其他中藥制劑的多指標成分的同時測定。

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（收稿日期：2019-02-11 修回日期：2019-06-28）

（編輯：段思怡）