腹水草水提液對胃潰瘍大鼠PGE2和COX-2表達的影響

張海霞 任偉銘 祁依佳 沈貴芳 趙偉春

摘要：目的：研究腹水草Veronicastrum axillare水提液對乙醇造模胃潰瘍大鼠前列腺素E2（PGE2）和COX-2表達的影響。方法：將SD大鼠隨機分成6組，每組8只。正常組和模型組給予0.9%生理鹽水灌胃;雷尼替丁組給予0.027 g/kg·d雷尼替丁混懸液灌胃;腹水草高、中、低劑量組分別給予2.8 g/kg·d、1.4 g/kg·d和0.7 g/kg·d腹水草水提液灌胃。連續(xù)給藥14d，于最后一次灌胃后，用無水乙醇制備胃潰瘍模型。采用夾心ELISA、RT-PCR和Western Blot分析腹水草水提液對大鼠胃組織PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表達的影響。結(jié)果：模型組大鼠胃組織中PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表達水平顯著低于正常組，而腹水草水提液顯著提高大鼠胃組織中PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表達水平。結(jié)論：腹水草水提液通過調(diào)節(jié)COX-2表達水平，使得胃組織中PGE2的含量增加，從而保護胃黏膜。

關(guān)鍵詞：腹水草;胃潰瘍;前列腺素E2;環(huán)氧合酶2

中圖分類號：R285 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-2177（2019）17-0123-03

胃潰瘍是臨床上常見、多發(fā)性疾病。全球每年有1400多萬人被診斷為胃潰瘍，約400萬人死于相關(guān)并發(fā)癥[1]。關(guān)于胃潰瘍的發(fā)病機制，目前被廣泛接受的是攻擊因子和防御因子失衡學(xué)說[2]。胃潰瘍主要攻擊因子有胃酸，腫瘤壞死因數(shù)，內(nèi)皮素等。主要防御因子有NO及NO合成酶，前列腺素（PGs），表皮生長因子等。PGs不在細胞中貯存，一旦機體需要，能很快通過環(huán)氧合酶（COX）反應(yīng)合成。COX-2誘導(dǎo)的直接結(jié)果是以前列腺素E2（PGE2）為主的PGs產(chǎn)物的合成增加，從而保護胃黏膜。PGE2是最重要的胃黏膜保護因子之一[3]，COX是PGs合成過程中重要的限速酶。在明確腹水草水提液抗大鼠乙醇型胃潰瘍的效果的基礎(chǔ)上[4]，本文分析了腹水草水提液對PGE2及COX-2的表達的影響，為明確腹水草對抗大鼠乙醇型胃潰瘍的作用途徑提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級SD大鼠48只，6～7周齡，體重180g～220g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。腹水草水提液的制備方法見沈貴芳等[4]。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒（批號：00064478）。PGE2試劑盒（批號：CK-E90201R），上海源葉生物科技有限公司。COX-2兔抗鼠多抗（批號：BA0738），武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。β-Actin Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（均購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司生產(chǎn)。批號分別為：214673和214575）。

1.2 分組、給藥與造模

將48只大鼠按性別分層隨機化分成6組，每組8只。正常組和模型組灌胃生理鹽水（4mL/只）;雷尼替丁組灌胃0.18%雷尼替丁混懸液（0.027g/kg·d，0.0054g/只，臨床劑量的3倍）;腹水草各劑量組分別灌胃高、中、低劑量腹水草水提液（2.8、1.4、0.7g/kg·d，4mL/只），1次/d，連續(xù)給藥14d。第14d給藥后1h，正常組灌胃1mL/只生理鹽水，其余大鼠均灌胃1mL/只無水乙醇造模，造模前禁食自由飲水24h。

1.3 胃黏膜組織中PGE2的測定

取部分胃組織于0℃下勻漿，于4℃下20000r/min離心20min，取上清液。采用抗體夾心ELISA方法，測定胃黏膜組織中PGE2的含量。

1.4 胃黏膜組織中COX-2蛋白的測定

采用RIPA裂解液提取胃黏膜組織蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進行Western Blot分析。以COX-2/β-actin蛋白條帶的密度比值作為COX-2的相對表達量。

1.5 胃黏膜組織中COX-2 mRNA的測定

采用Trizol試劑提取胃黏膜組織總RNA，經(jīng)非變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性后按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。COX-2的PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性4min ;94℃變性30s;56℃退火30s;72℃延伸1min，30個循環(huán);72℃充分延伸8min;β-actin的PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3min;94℃變性1min;60℃退火45s;72℃延伸1min，25個循環(huán);72℃充分延伸10min;PCR擴增結(jié)束經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析，以COX-2/β-actin比值表示各樣本mRNA的相對含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，組間比較采用LSD單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織中PGE2含量的比較

結(jié)果見表1。模型組、雷尼替丁組和腹水草各劑量組大鼠胃黏膜組織PGE2含量均顯著低于正常組（P <0.05，P <0.01）。與模型組相比，腹水草各劑量組、雷尼替丁組的PGE2含量均顯著提高（P <0.05，P <0.01）。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2蛋白含量的比較

模型組、腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠COX-2蛋白的表達量顯著高于正常組（圖1，圖2）。與模型組比較，腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠的COX-2蛋白水平顯著增加（P <0.01），其中腹水草高劑量組是模型組大鼠的3.9倍，是正常組大鼠的13.2倍。腹水草各劑量組大鼠的COX-2蛋白水平亦顯著高于雷尼替丁組。腹水草低、中、高劑量組間的COX-2蛋白水平亦隨著腹水草劑量的升高而提高（P <0.01）。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2 mRNA的比較

正常組大鼠胃黏膜組織內(nèi)COX-2 mRNA的表達量最低，COX-2/β-actin為0.071±0.018（圖3，圖4）。腹水草各劑量組、雷尼替丁組和模型組COX-2 mRNA水平均顯著高于正常組，其中腹水草高劑量組是正常大鼠的11.4倍（P <0.01）。雷尼替丁組、腹水草中劑量組和腹水草高劑量組的COX-2 mRNA的表達量高于模型組（P <0.01）。腹水草各劑量組間COX-2 mRNA的表達量差異不顯著（P >0.05）。

3 討論

PGE2是最重要的胃黏膜保護因子之一，但其保護胃黏膜的機制尚未闡明。一般認為，與其促進黏液及HCO3-的分泌，改善細胞內(nèi)對H+的中和能力，增加表面疏水性、保護黏膜屏障、調(diào)節(jié)胃黏膜血流量等有關(guān)。已有研究表明，雙蒲散提高潰瘍愈合質(zhì)量的機制可能是增加胃黏膜組織PGE2含量，促進黏膜修復(fù)[5]。酒速愈可通過升高胃黏膜PGE2含量，加強胃黏膜的黏液—碳酸氫鹽屏障，減輕乙醇對胃黏膜的損傷[6]。腹水草具有去腐生肌和散血逐瘀的作用[4]，本實驗表明，腹水草水提液通過促進胃組織中PGE2的合成及釋放來保護胃黏膜。

PGE2在體內(nèi)由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）所合成。細胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下生成花生四烯酸，花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成環(huán)內(nèi)過氧化物前列腺素G2（PGG2）、前列腺素H2（PGH2）。PGH2很不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)變成前列腺素E2（PGE2）和血栓素A2（TXA2）等物質(zhì)。研究認為[7]，在正常大鼠胃黏膜組織中，COX-2蛋白幾乎無表達，COX-2 mRNA的表達量很少;但在胃潰瘍發(fā)生或潰瘍愈合的過程中，COX-2蛋白大量表達，COX-2 mRNA的表達量急劇上升。本實驗結(jié)果亦表明，腹水草水提液能提高COX-2 mRNA和COX-2蛋白表達量，促使胃黏膜組織中PGE2含量增加，進而調(diào)節(jié)胃粘液及黏膜血流量，保護黏膜屏障，從而抑制胃潰瘍的發(fā)生。

參考文獻

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（編輯：周安琪）

Abstract：Objective： The study was to observe the antiulcer effect of the decoction of Veronicastrum axillare on gastric ulcer in rat induced by ethanol， and the effect of V. axillare on the expression of PGE2 and COX-2.Methods： 48 SD rats were randomly divided into 6 groups. Normal group and model group were given 0.9% normal saline respectively. Ranitidine group were given 0.18% ranitidine suspension （0.027 g/kg·d）. The high dose group， medium dose group and low dose group were gavaged with 2.8g/kg·d， 1.4g/kg·d and 0.7 g/kg·d of the decoction of V. axillare for 14 consecutive days respectively. After gavaging for the last time， the gastric ulcer models were prepared by gavaged with ethanol. The rats were killed one hour later. Using the method of ELISA， RT-PCR and Western Blot， the effect of V. axillare on the expression of PGE2， COX-2 mRNA and COX-2 protein were analyzed. Results： The decoction of V.axillare significantly increased the level of PGE2 in gastric tissue of rats. They efficiently promoted the mRNA and protein expressions of COX-2（Compared with the model control group， P <0.01）. Conclusions： The decoction of V. axillare can effectively improve the expression levels of COX-2 mRNA and protein. This caused the increase of PGE2 content in gastric tissue， thereby protecting gastric mucosa and against the occurrence of ethanol-induced gastric ulcer.

Key words：Veronicastrum axillare; gastric ulcer; PGE2; COX-2