鴿毛滴蟲分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

陸雨楠 陳俊紅 陳羽 朱秋陽 曹彬彬 陳瑾 戴鼎震

摘要：在生產(chǎn)飼養(yǎng)中，鴿毛滴蟲感染鴿的情況較為普遍和嚴(yán)重，嚴(yán)重影響鴿的健康和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該文提供一種分離培養(yǎng)鴿毛滴蟲并對其形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察的有效方法，為更好地了解鴿毛滴蟲的形態(tài)和預(yù)防控制提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：鴿毛滴蟲;體外培養(yǎng);形態(tài)學(xué);掃描電子顯微鏡

中圖分類號(hào)：S858.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.16.003

0 引言

鴿毛滴蟲?。≒igeon Canker）又稱口腔潰瘍，是鴿最常見的一種傳染性原蟲病[1-2]。鴿毛滴蟲屬原生動(dòng)物門，鞭毛綱，動(dòng)鞭亞綱，多鞭毛目，毛滴蟲科，毛滴蟲屬的禽毛滴蟲[3-4]。該病的傳染源主要為病鴿。患病的成年鴿可通過互相接吻或嗉囊哺育幼鴿，將鴿毛滴蟲直接傳遞給同伴或幼鴿。另外，鴿毛滴蟲還可通過污染的飼料、鴿巢墊料、傷口等途徑感染鴿群[5]。鴿毛滴蟲病主要造成鴿上消化道和嗉囊粘膜上出現(xiàn)黃色潰瘍狀結(jié)節(jié)，阻礙鴿的正常進(jìn)食和呼吸，導(dǎo)致患病鴿饑餓死亡。成年鴿大多為帶蟲者，癥狀表現(xiàn)不明顯。幼鴿癥狀表現(xiàn)明顯，排出綠色粘液樣糞便、羽毛雜亂且無光澤、消瘦、呼吸聲加重等[6]。鴿毛滴蟲大多是與大腸桿菌、念球菌等混合感染，單獨(dú)感染鴿毛滴蟲的病例較少。隨著養(yǎng)鴿業(yè)的集約化發(fā)展，鴿毛滴蟲病也變成養(yǎng)鴿場的常見病。鴿毛滴蟲病因特殊的傳播方式，短期內(nèi)不能將其消滅干凈，導(dǎo)致幼鴿發(fā)病率較高，對鴿養(yǎng)殖業(yè)造成了比較嚴(yán)重的危害[7]。然而，目前對鴿毛滴蟲形態(tài)學(xué)的研究相對于陰道毛滴蟲形態(tài)學(xué)的較少，為從根本上防治鴿毛滴蟲，對鴿毛滴蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察具有重要意義。鴿毛滴蟲體外培養(yǎng)的應(yīng)用對進(jìn)行抗鴿毛滴蟲的體外藥敏試驗(yàn)及鴿毛滴蟲形態(tài)學(xué)的研究提供了有利條件[8-9]。毛滴蟲對體外培養(yǎng)的要求比較高，與培養(yǎng)基的pH值、環(huán)境溫度、營養(yǎng)物質(zhì)等因素密切相關(guān)，但培養(yǎng)成功后檢出率高。對鴿毛滴蟲進(jìn)行了體外分離、純化培養(yǎng)，并測定鴿毛滴蟲的增殖密度。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對染色后的蟲體進(jìn)行形態(tài)觀察，并應(yīng)用掃描電子顯微鏡更清晰的觀察鴿毛滴蟲的外表面結(jié)構(gòu)，為更好了解鴿毛滴蟲的形態(tài)提供了資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)用鴿毛滴蟲樣品

采集自患毛滴蟲病的白羽王鴿的口腔及咽喉處的干酪樣沉著物。

1.1.2藥品與試劑

注射用硫酸鏈霉素（100萬IU）、注射用青霉素鉀（160萬IU）、瑞氏一吉姆薩染色液（濟(jì)南百博生物科技股份有限公司）、革蘭氏染色液（濟(jì)南百博生物科技股份有限公司）、L-半胱氨酸鹽酸鹽和標(biāo)準(zhǔn)小牛血清（鄭州益康生物工程有限公司）、鴿子血清、小牛血清、麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉、香柏油、3%戊二醛。

1.2方法

1.2.1肝浸湯培養(yǎng)基制備

取15g新鮮豬肝，先除去筋膜，再剪成米粒大小放入燒杯。加入100mL蒸餾水，放入冰箱保存24h。次日取出蒸煮30min。用紗布過濾取上清液，后加入0.5g氯化鈉、1g麥芽糖、0.2gL-半胱氨酸鹽酸鹽、最后加入2g蛋白胨直至溶解，再用濾紙過濾。將濾液加蒸餾水定容至100mL，調(diào)pH至6，裝入無菌玻璃瓶中，置于高溫高壓滅菌器內(nèi)121℃，30min高溫高壓滅菌。冷卻后置于4℃冰箱保存。抽取16mL肝浸湯溶解2瓶注射用硫酸鏈霉素（100萬IU）和一瓶注射用青霉素鉀（160萬IU），待溶解均勻后裝于無菌玻璃瓶內(nèi)放置于冰箱內(nèi)4℃保存。取3.5mL的無菌肝浸湯于無菌試管中，加入0.5mL的雙抗溶液和1mL的鴿子血清，混勻后即可接種鴿毛滴蟲。

1.2.2鴿毛滴蟲分離鑒定

用無菌棉拭子采集鴿口腔樣本后，放于無菌試管中封閉保存帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣本接種于已制備好的毛滴蟲液體培養(yǎng)基，37℃恒溫箱靜置培養(yǎng)48h。培養(yǎng)48h后混勻培養(yǎng)物，取一滴涂片后用光學(xué)顯微鏡鏡檢，如能發(fā)現(xiàn)梨形或者橢圓形，有折光性，不斷運(yùn)動(dòng)的蟲體，可初步診斷為鴿毛滴蟲病[10]。

1.2.3鴿毛滴蟲純化培養(yǎng)

從采集的鴿毛滴蟲樣品中選擇蟲體活性狀態(tài)好，且細(xì)菌和真菌相對較少的樣品接種于5mL鴿毛滴蟲肝浸湯培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行第1代傳代培養(yǎng)，每隔48h傳代一次，傳代至3代后，鴿毛滴蟲培養(yǎng)基中細(xì)菌和真菌基本被消滅，繼續(xù)每隔48h傳代，得到較單純的鴿毛滴蟲培養(yǎng)基。

1.2.4鴿毛滴蟲光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察

該試驗(yàn)中，將純化傳代至第4代的鴿毛滴蟲培養(yǎng)基樣品取適量涂于載玻片上，用酒精燈加熱固定，經(jīng)瑞氏一吉姆薩染色和革蘭氏染色后，按低倍鏡一高倍鏡的順序觀察涂片。

1.2.5掃描電子顯微鏡樣本制備

含有毛滴蟲的肝浸湯培養(yǎng)基800r/min，離心10min，取上清液。將上清液再次離心，3000r/min，離心10min。離心后舍棄上清液，收集蟲體，取沉淀物。用3%戊二醛4℃固定過夜，用掃描電子顯微鏡觀察鴿毛滴蟲的形態(tài)。

1.2.6鴿毛滴蟲生長曲線測定

本次試驗(yàn)接種的樣本為傳代至第四代，且生長了48h的鴿毛滴蟲。用同一管的樣本接種了三管肝浸湯培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)。待接種后，每隔12h計(jì)數(shù)一次，直至蟲體全部死亡。并根據(jù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)繪制鴿毛滴蟲的生長曲線。

1.2.7藥物作用下鴿毛滴蟲形態(tài)學(xué)變化觀察

以鴿毛滴蟲在體外培養(yǎng)基中的生長曲線為依據(jù)，該試驗(yàn)將純化培養(yǎng)至第四代且生長至48h的蟲體應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)，因?yàn)樯L至48～60h的鴿毛滴蟲增殖快且活性最強(qiáng)，因此可以確保用藥后鴿毛滴蟲的生長穩(wěn)定。該藥敏試驗(yàn)以48h作為體外藥敏試驗(yàn)的周期，以此避免由于時(shí)間過長鴿毛滴蟲正常死亡造成試驗(yàn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1鴿毛滴蟲活體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

鴿毛滴蟲活蟲體呈橢圓形、圓形、或梨形，有折光性。光鏡下的活蟲體有的向左有或向前運(yùn)動(dòng)、有的呈旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)或布朗運(yùn)動(dòng)[4]，蟲體運(yùn)動(dòng)迅速，活性非常強(qiáng)。見圖1。

2.2鴿毛滴蟲染色后的形態(tài)觀察結(jié)果

在1000倍油鏡下，經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后的蟲體呈橢圓形或不規(guī)則形。蟲體原生質(zhì)被染成淡藍(lán)色。細(xì)胞核呈橢圓形，且被染成紅色，并位于蟲體前端[4]。鞭毛呈暗紅色或黑色，暗視野下能清晰觀察到4根前鞭毛。軸柱顏色淺于原生質(zhì)，且稍突出于蟲體后緣。一側(cè)可清晰觀察到波動(dòng)膜外邊緣的輪廓，顏色比原生質(zhì)稍淺（如圖2A）。經(jīng)革蘭氏染色后的蟲體呈橢圓形或不規(guī)則形。蟲體原生質(zhì)呈淡紅色，細(xì)胞核的顏色比原生質(zhì)深。能觀察到呈黑色的4根鞭毛和波動(dòng)膜邊緣輪廓。軸柱突出于蟲體后緣，呈淡紅色（如圖2B）。

2.3不同生長期鴿毛滴蟲的形態(tài)觀察結(jié)果

鴿毛滴蟲生長到60h進(jìn)行吉姆薩染色后，著色明顯，暗視野下能觀察到鞭毛。軸柱突出于蟲體外，著色較原生質(zhì)淡。蟲體細(xì)胞核著色較原生質(zhì)深，蟲體輪廓清晰（圖3C）。極少數(shù)鴿毛滴蟲生長了120h后死亡，大多數(shù)鴿毛滴蟲在生長衰亡期死亡，少數(shù)在生長遲緩期、生長對數(shù)期及生長穩(wěn)定期死亡。取接種鴿毛滴蟲樣本120h后的培養(yǎng)基，經(jīng)吉姆薩染色后，細(xì)胞核著色明顯，多數(shù)蟲體的鞭毛脫落，蟲體胞膜破裂，形成空洞，原生質(zhì)溢出，空洞擴(kuò)大后，蟲體裂解形成碎片。死亡裂解后的鴿毛滴蟲著色較活的鴿毛滴蟲淡（圖3D）。

2.4鴿毛滴蟲掃描電子顯微鏡的形態(tài)觀察結(jié)果

鴿毛滴蟲呈卵圓形或球形。如圖4E所示，在掃描電子顯微鏡下，60h前活力較強(qiáng)，鴿毛滴蟲表面較為光滑，上面分布少許褶皺，可清晰的觀察到四條前鞭毛，這些鞭毛起源于蟲體前端毛基體的游離鞭毛。發(fā)育發(fā)達(dá)的波動(dòng)膜起始于蟲體的前端，波動(dòng)膜幾乎可以延伸到身體的整個(gè)長度。一根軸柱延伸出蟲體的后緣。后蟲體開始衰老，蟲體開始皺縮，表面粗糙（如圖4F所示）。繼而，鴿毛滴蟲表面皺縮加深，空洞變大，如圖4G所示，蟲體輪廓及鞭毛不清晰。在接近120h時(shí)，蟲體崩解（如圖4H所示）。

2.5鴿毛滴蟲生長曲線測定結(jié)果

對鴿毛滴蟲在肝浸湯培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示：蟲體在肝浸湯培養(yǎng)基中生長良好，在接種了蟲體12h內(nèi)鴿毛滴蟲增殖不太明顯;12～48h鴿毛滴蟲增殖明顯，蟲體數(shù)量緩慢增加;48～60h鴿毛滴蟲數(shù)量呈直線上升，蟲體呈對數(shù)增長;蟲體在60h左右，蟲體密度及活性最強(qiáng);接種鴿毛滴蟲60h后，鴿毛滴蟲數(shù)量達(dá)最高峰，后則迅速下降;在接種后的第3天，鴿毛滴蟲平均數(shù)為97.07×10 5個(gè)/mL，蟲體數(shù)量最多;至84h時(shí)，顯微鏡視野下可見大量死亡蟲體;84h后蟲體緩慢死亡，直至120h，蟲體全部死亡。鴿毛滴蟲生長曲線見圖5。

3 討論

鴿毛滴蟲在外界環(huán)境中抵抗力低，鴿毛滴蟲對體外培養(yǎng)基有特殊的營養(yǎng)要求，需加血清才能生長及適量的兩性霉素才能存活。進(jìn)行鴿毛滴蟲體外接種培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)在無菌條件下完成操作，避免細(xì)菌污染培養(yǎng)基，保證鴿毛滴蟲的純化培養(yǎng)。此次試驗(yàn)還應(yīng)用小牛血清培養(yǎng)鴿毛滴蟲，但是，培養(yǎng)了48h后取培養(yǎng)液進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)此次用小牛血清培養(yǎng)的鴿毛滴蟲數(shù)量較少。所以試驗(yàn)用的鴿毛滴蟲皆使用鴿子血清進(jìn)行培養(yǎng)。用鴿子血清培養(yǎng)的毛滴蟲數(shù)量增加迅速，視野內(nèi)蟲體運(yùn)動(dòng)迅速，活性非常強(qiáng)。從鴿毛滴蟲的生長曲線表明，用肝浸湯培養(yǎng)的鴿毛滴蟲接種后60h增殖達(dá)到高峰的活蟲體數(shù)比張靜靜等人報(bào)道的HF培養(yǎng)基中的鴿毛滴蟲的數(shù)量多。但是，肝浸湯培養(yǎng)容易產(chǎn)生肝雜質(zhì)，在后期不利于蟲體的觀察和計(jì)數(shù)[10]。

此次試驗(yàn)用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡分別觀察了鴿毛滴蟲的形態(tài)，在100倍光學(xué)顯微鏡下能觀察到有折光性、圓形或橢圓形，且快速游動(dòng)的鴿毛滴蟲。在1000倍油鏡下，通過吉姆薩染色后能觀察到鴿毛滴蟲呈橢圓形或不規(guī)則形。蟲體原生質(zhì)被染成淡藍(lán)色，橢圓形的細(xì)胞核呈紅色，暗視野下能清晰的觀察到4根不等的前鞭毛。在掃描電子顯微鏡下，正常的鴿毛滴蟲呈梨形或球形。鴿毛滴蟲表面出現(xiàn)褶皺或折痕。蟲體飽滿，各個(gè)外表面結(jié)構(gòu)輪廓清晰，并可清晰觀察到4條前鞭毛。發(fā)育發(fā)達(dá)的波動(dòng)膜幾乎可以延伸到蟲體的整個(gè)長度。

4 結(jié)論

試驗(yàn)觀察到鴿毛滴蟲在肝浸湯培養(yǎng)基中生長繁殖過程，從接種到60h生長良好，可達(dá)生長高峰，蟲體飽滿，運(yùn)動(dòng)迅速，表面光滑，后呈下降趨勢，蟲體數(shù)量減少，死亡增多，蟲體呈萎縮、出現(xiàn)空洞，崩解，并在120h達(dá)到死亡底限。本試驗(yàn)結(jié)果建立了可靠的鴿毛滴蟲培養(yǎng)方法，弄清了鴿毛滴蟲的生長規(guī)律，為檢測、分離鑒定以及篩選抗鴿毛滴蟲藥物提供了基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練，省重點(diǎn)項(xiàng)目（201813573013Z）

作者簡介：陸雨楠（1997-），女，江蘇省南通人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)學(xué)研究。

通信作者：戴鼎震（1964-），男，江蘇興化人，博士，教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)及中獸醫(yī)的研究。