枇杷葉中三萜酸的提取、分離和檢測研究進(jìn)展*

李子溪，江 岸

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000)

1 前言

枇杷 (Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.)是薔薇科 (Rosaceae)枇杷屬植物，原產(chǎn)于我國，主要分布于中南及陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南等地。枇杷葉又名巴葉、蘆桔葉，是傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)常用的中藥，一般認(rèn)為其味苦，性微寒，歸肺、胃二經(jīng)，具有抗炎抑菌、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性［1］。枇杷葉中含有三萜酸、黃酮、糖苷等多種化學(xué)成分，其藥理作用主要集中在三萜酸上，因而有關(guān)枇杷葉中三萜酸的研究受到廣泛關(guān)注。

2 枇杷葉中三萜酸的種類

枇杷葉中的三萜酸類化合物有十余種，主要為五環(huán)三萜類化合物，以烏蘇烷型和齊墩果烷型居多，包括熊果酸 (烏索酸，烏蘇酸，Ursolic acid)［2］及以熊果酸為母核的科羅索酸(2α －羥基熊果酸，Corosolic acid)［2］、2α，19α －二羥基 －3－羰基 －12－烯 －28－烏蘇酸(2α，19α －dihydroxyurs－3－oxo－12－en－28－oic acid)［2］、2α，3β，13β －三羥基 －11－烯－28－烏蘇酸 (2α，3β，13β －trihydroxyurs－11－en－28－oic acid)［2］、坡模酸 (Pomolic acid)［3］、薔薇酸 (Euscaphic acid)［2］、委陵菜酸 (tormertic acid)［4］、2α，3α － 二羥基 －12－烯 －28－烏蘇酸 (2α，3α －dihydroxyurs－12－en－28－oic acid)［5］、2β，3β，19α －三羥基 －12－烯 －28－烏蘇酸 (2β，3β，19α －trihydroxyurs－12－en－28－oic acid)。［5］、3β，6β，19α－三羥基－12－烯 －28－烏蘇酸 (3β，6β，19α － trihydroxyurs－12－en－28－oic acid)［6］、23－反式 －對香豆酰委陵菜酸 (23－ trans－ p －coumaroyltormentic acid)［6］、23－順式－對香豆酰委陵菜酸 (23－cis－p－coumaroyltormentic acid)［6］、3－O－反式－咖啡酰委陵菜酸 (3－O－tran－cafhyltormentic acid)［6］、3－O－反式 －對香豆酰救必應(yīng)酸 (3－O－ tran － p － coumaroylrotundic acid)［6］，齊墩果酸 (Oleanolic acid)［2］及以齊墩果酸為母核的2α，3α，19α，23－四羥基－12－烯－28－齊墩果酸 (2α，3α，19α，23－tetrahydroxyolean－12 －en－28 － oic acid)［2］、馬斯里酸 (2α － 羥基齊墩果酸，maslinic acid)［3］、阿江欖仁酸(ursolic acid)［7］、2α，3α，19α － 三羥基 －12 － 烯 －28 － 齊墩果酸 (2α，3α，19α －trihydroxyolean－12－en－28－oic acid)［7］等多種三萜酸。其中，熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure formula of ursolic acid and oleanolic acid

3 枇杷葉中三萜酸的提取

目前，從枇杷葉中提取三萜酸的方法主要有浸提法、回流提取法、超聲輔助提取法、超臨界CO2萃取法、微波提取法等。由于溶劑的毒性和三萜酸溶解度等原因，乙醇是最常用的提取溶劑，但也有使用甲醇［8］和乙醚［9］的報(bào)道。

回流提取法是較常用的提取方法，除了干燥［10］、粉碎［10］之外，原料亦可先經(jīng)復(fù)合酶制劑發(fā)酵［11］或乙醚脫脂［12］預(yù)處理。不同的課題組分別研究了乙醇回流提取枇杷葉中熊果酸［13，14］、齊墩果酸［14］和科羅索酸［10］的工藝，發(fā)現(xiàn)除乙醇濃度之外，提取效率還受到粉碎粒度、料液比、溫度等因素的影響，而提取時(shí)間和次數(shù)達(dá)到一定程度之后，提取效率不會(huì)繼續(xù)提高。

李開泉等［15］比較了超聲提取法與回流提取法對枇杷葉中熊果酸的提取效果，發(fā)現(xiàn)由于超聲波具有特殊的機(jī)械、空化及熱效應(yīng)，加大了介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，從而增強(qiáng)介質(zhì)的穿透力，使有效成分得以充分溶出，提取的效率為熱回流法的2.63倍。除了溫度、料葉比、提取時(shí)間等因素之外，超聲波的頻率也對提取效果有顯著影響［16］。

超臨界CO2萃取技術(shù)以超臨界CO2為溶劑，利用其溶解性和滲透能力，調(diào)節(jié)萃取體系的參數(shù)，使處于超臨界狀態(tài)下的流體對定組分的溶解度急劇增加，從而對混合物進(jìn)行分離，克服了傳統(tǒng)萃取方法中有機(jī)溶劑殘留的問題。蔣盛巖等［17］利用超臨界CO2萃取技術(shù)提取枇杷葉中的熊果酸，并對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)各參數(shù)影響程度為萃取溫度＞萃取時(shí)間＞攜帶劑的添加量＞萃取壓力。張慧恩等［18］則認(rèn)為各參數(shù)影響程度應(yīng)為萃取壓力＞萃取溫度＞動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間。

微波提取利用微波的熱效應(yīng)加熱樣品和有機(jī)溶劑，根據(jù)物質(zhì)吸收微波能力的差異實(shí)現(xiàn)選擇性加熱，使得被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，達(dá)到提取的目的，具有萃取效率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)［19］。樊愛萍等［20］通過微波提取枇杷葉中齊墩果酸證明用微波提取的效果優(yōu)于加熱回流、冷浸提取，并優(yōu)化了工藝條件。蔣珍菊等［21］則提出了完全不同的工藝參數(shù)。

4 枇杷葉中三萜酸的純化

除各種三萜酸外，枇杷葉中還含有揮發(fā)油類、三萜酸類、黃酮類、皂甙類、有機(jī)酸類、多酚類等多種成分，這些物質(zhì)在粗提物中大量存在，必須經(jīng)過進(jìn)一步處理，方可得到純度較高的產(chǎn)品。粗提物的純化方法有柱色譜法［4］、重結(jié)晶法［22］、HPLC法［23］等。

呂寒等［4］將濃縮后的粗提物經(jīng)柱層析，用不同極性的溶劑梯度洗脫，得到的各組分再經(jīng)反復(fù)層析，成功分離熊果酸、齊墩果酸、馬斯里酸、薔薇酸、科羅索酸、委陵菜酸等多種三萜酸。柱色譜分離之前，亦可先用不同溶劑萃取粗提物進(jìn)行初步分離［2］。吳梨等［22］用大孔吸附樹脂梯度洗提的方法處理枇杷葉乙醇提取物，并將得到的熊果酸粗產(chǎn)物進(jìn)行5次重結(jié)晶，使產(chǎn)品中熊果酸純度從不足10%提高到95.3%。李麗等［24］采用不同型號的大孔吸附樹脂純化熊果酸，也得到純度95%的產(chǎn)品。

另外，李開泉等［25］用自制的除雜劑處理乙醇回流后的浸膏，除去脂類、樹脂類及葉綠素等雜質(zhì)，進(jìn)一步純化后得到熊果酸。相延英等［26］將反復(fù)洗滌并經(jīng)活性炭脫色的樣品重結(jié)晶，得到的熊果酸晶體純度達(dá)94.0%。呂楊等［27］則用半制備HPLC分離了乙醇提取物中的科羅索酸和馬斯里酸。

5 枇杷葉中三萜酸的分析檢測

薄層層析法是較早的測定枇杷葉中三萜酸的方法。韓小龍等［28］以環(huán)己烷－氯仿－醋酸乙酯－冰醋酸為展開劑，測定不同含量的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在硅膠GF254板上展開后的斑點(diǎn)吸收峰峰面積，發(fā)現(xiàn)熊果酸在0.75～3.75 μg范圍內(nèi)時(shí)，含量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。另外，魯湘鄂等［9］曾以氯仿－甲醇－冰醋酸為展開劑，用薄層色譜法對枇杷葉中的齊墩果酸進(jìn)行定性鑒別。

除了薄層層析法之外，HPLC法也是測定枇杷葉中三萜酸含量的重要方法。胡長平等［29］以甲醇－醋酸水溶液為流動(dòng)相，在C18色譜柱上實(shí)現(xiàn)科羅索酸與其他枇杷葉提取成分的分離，并借助色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，測定了科羅索酸的含量。鄒盛勤等［30］則用Symmetry Shield RP18色譜柱和甲醇－水為流動(dòng)相，測定了枇杷葉提取物中熊果酸的含量。

熊果酸和齊墩果酸是枇杷葉中含量最高的三萜酸，兩者為互同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似，分離較困難，HPLC法同時(shí)測定熊果酸和齊墩果酸含量的分析方法受到廣泛關(guān)注。唐麗琴等［31］用多種流動(dòng)相配合C18色譜柱測定枇杷葉中兩種三萜酸，發(fā)現(xiàn)甲醇－水－冰醋酸是最理想的流動(dòng)相。杜豐玉等［32］采用反相高效液相色譜法，比較了來自不同產(chǎn)地的10批枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量。陳龍勝等［33］則用反相高效液相色譜法同時(shí)測定了熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和山楂酸。

毛細(xì)管電泳法也被用于測定枇杷葉中三萜酸的含量。肖美添等［34］采用膠束毛細(xì)管測定枇杷葉中的熊果酸和齊墩果酸，并研究了背景電解質(zhì)的種類和濃度、pH值、運(yùn)行緩沖液對分離的影響。張鋒等［35］采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，高頻電導(dǎo)檢測枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸，考察了不同種類、不同濃度不同配比的緩沖溶液pH值、添加劑，優(yōu)化了測試條件。

另外，何曉文等［12］采用冰醋酸－香草醛為顯色劑，高氯酸為穩(wěn)定劑，用分光光度法測定了枇杷葉中總?cè)莆镔|(zhì)的含量。

6 總結(jié)

對枇杷葉中三萜酸提取、分離以及醫(yī)學(xué)活性的研究，有助于更好地利用枇杷葉資源。但在枇杷葉中含有的各種三萜酸中，有關(guān)熊果酸和齊墩果酸的研究進(jìn)行得比較深入，而科羅索酸等其它三萜酸的分離、檢測報(bào)道較少。這些三萜酸的分離工藝、檢測手段和生物活性還有待進(jìn)一步研究。

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