粉防己堿對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖和遷移、侵襲能力的影響及其機制研究

鄧香

中圖分類號 R730.264；R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0211-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.14

摘 要 目的：探討粉防己堿（TET）對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖和遷移、侵襲能力的影響及其作用機制。方法：以人神經(jīng)母細胞瘤細胞系IMR-32細胞、SH-SY5Y細胞為研究對象，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）方法檢測濃度分別為0（空白對照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L的TET對細胞增殖的影響；采用Transwell小室遷移實驗和侵襲實驗，考察正常對照組（TET濃度為0 μmol/L）和TET組（10 μmol/L，IMR-32細胞；15 μmol/L，SH-SY5Y細胞）的細胞跨膜情況；采用Western blotting法檢測按上述濃度TET處理后的IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞中金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK3β）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）的蛋白表達水平。結(jié)果：5、10、15、20 μmol/L的TET可顯著降低IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的存活率（P<0.05或P<0.01），其半數(shù)抑制濃度分別為10.148、14.461 μmol/L。細胞遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，TET組跨膜細胞數(shù)均顯著減少（P<0.01）；Western blotting法檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，TET組細胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin、p-GSK3β蛋白表達均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：TET對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和遷移、侵襲能力具有明顯的抑制作用，其機制與下調(diào)細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達及抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

關鍵詞 粉防己堿；神經(jīng)母細胞瘤；IMR-32細胞；SH-SY5Y細胞；增殖；遷移；侵襲

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of tetrandrine （TET） on the proliferation and migration， invasion ability of neuroblastoma cells and its mechanism. METHODS： Human neuroblastoma cell lines IMR-32 and SH-SY5Y were chosen as objects. MTT assay was used to detect the effects of 0 （blank control）， 2.5， 5， 10， 15， 20 μmol/L TET on cell proliferation. The transmembrane number of normal control group （TET concentration of 0 μmol/L） and TET group （10 μmol/L for IMR-32 cells， 15 μmol/L for SH-SY5Y cells） were investigated by Transwell cell migration and invasion experiments. The protein levels of MMP-2， MMP-9， β-catenin， GSK3β and p-GSK3β in IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were tested by Western blotting assay after treated with TET of above concentrations. RESULTS： TET with 5， 10， 15， 20 μmol/L can reduce the survival rate of IMR-32 cells and SH-SY5Y cells significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC50 of which to IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were 10.148 and 14.461 μmol/L， respectively. Results of migration and invasion experiments showed that compared with normal control group， the number of transmembrane cells was decreased significantly in TET group （P<0.01）. Results of Western blotting assay showed that compared with normal control group， the protein expression levels of MMP-2，MMP-9，β-catenin and p-GSK3β were decreased significantly in TET group （P<0.01）. CONCLUSIONS： TET shows significant inhibitory effects on the proliferation， migration and invasion ability of neuroblastoma cells， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of MMP-2 and MMP-9 and inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway.

KEYWORDS Tetrandrine； Neuroblastoma； IMR-32 cell； SH-SY5Y cell； Proliferation； Migration； Invasion

神經(jīng)母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）是兒童常見的惡性實體腫瘤，其起源于交感神經(jīng)神經(jīng)嵴，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤；由于NB具有較高的異質(zhì)性，且其存在惡性程度高、生長迅速、容易轉(zhuǎn)移等特點，故患者治療效果差、預后差[1]。目前NB的治療手段主要包括手術切除、化療、放療、骨髓/造血干細胞移植及生物治療等，但一旦NB患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，則其病死率極高[2]。

粉防己堿（Tetrandrine，TET）屬于雙芐基異喹啉類生物堿，是從粉防己的根塊中提取出的有效成分，在治療高血壓、心律不齊、關節(jié)炎、炎癥甚至矽肺等方面發(fā)揮著重要作用[3-4]；此外，其在抗腫瘤如肝癌[5]、胃癌[6]、膀胱癌[7]及腎癌[8]等方面也具有一定功效。研究表明，TET主要通過直接的細胞毒性作用、抑制細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、保護正常組織免受放射損傷以及抗轉(zhuǎn)移、抗血管再生等途徑發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，其主要作用機制可能是激活線粒體死亡通路，進而誘導腫瘤細胞凋亡[9]。但TET 用于NB治療的相關研究報道較少。

IMR-32和SH-SY5Y細胞系來源于人NB細胞系，其在細胞形態(tài)和功能上與正常人神經(jīng)細胞有較多相似之處，因而成為顱內(nèi)腫瘤研究的重要細胞模型之一[10]。本研究以這類細胞系為研究對象，考察TET對NB細胞的增殖以及遷移、侵襲能力的影響，并通過檢測信號通路相關蛋白水平的變化探討TET抑制NB細胞的作用機制，以期為TET臨床用于治療NB以及探索新的NB治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

VIOS 160i型 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；細胞培養(yǎng)板（上海晶安生物科技有限公司）；JIDI-17R型微量高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；BDS200型倒置光學顯微鏡（北京奧特偉業(yè)光學儀器有限公司）；DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀（上海珂準儀器有限公司）；HCB1502型電子天平（英國ADAM公司）。

1.2 藥品與試劑

TET對照品（批號：T2695，純度：≥98%）、青霉素、鏈霉素（美國Sigma-Aldrich公司）；1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）兔單抗、MMP-9兔單抗（美國Santa Cruz公司）；β-catenin兔單抗、糖原合成激酶3β（GSK3β）兔單抗、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）兔單抗（美國CST公司）；β-actin抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記抗體（二抗，北京博爾西科技有限公司）；胰酶（廣州碧云天有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；多聚甲醛（北京雷根生物技術有限公司）；TBST緩沖液、結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）；化學發(fā)光（ECL）試劑、BCA試劑（美國Pierce公司）；蛋白上樣緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格；pH 7.2磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為實驗室自制；水為雙蒸水。

1.3 細胞

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系IMR-32細胞、SH-SY5Y細胞（美國ATCC細胞庫）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將IMR-32細胞、SH-SY5Y細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基（以下各試/實驗步驟相同），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每隔2～3 d進行換液，待細胞生長至80%～90%融合度時使用胰酶進行消化傳代培養(yǎng)。

2.2 TET對NB細胞的毒性作用考察

采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞，按8 000個/孔接種于96孔板。待細胞貼壁生長后吸棄培養(yǎng)基，加入終濃度分別為0（空白對照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L 的TET甲醇溶液，每種濃度設置5個復孔。將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；吸棄上清液，分別加入含1 mg/mL MTT的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；培養(yǎng)完畢后吸棄上清液，加入DMSO 150 μL，置于振蕩器上振蕩10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測細胞光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（OD試驗組/OD空白對照組）×100%。

2.3 TET對NB細胞遷移、侵襲能力的影響考察

2.3.1 NB細胞遷移實驗 取對數(shù)生長期的IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞并分為正常對照組、TET組，經(jīng)胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1.0×105個/mL。在Transwell上室加入細胞懸液200 μL，然后根據(jù)TET細胞毒性考察結(jié)果分別加入終濃度為0 μmol/L（正常對照組）、10 μmol/L（IMR-32細胞，TET組）或15 μmol/L（SH-SY5Y細胞，TET組）的TET甲醇溶液；下室加入含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基800 μL。各組細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出小室用棉簽擦拭上室，以4%多聚甲醛固定15 min，再以0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉簽擦拭上室。在光學顯微鏡下隨機挑選5個不同視野，拍照并計數(shù)跨膜細胞。

2.3.2 NB細胞侵襲實驗 取Matrigel基質(zhì)膠，以無血清培養(yǎng)基按照體積比8 ∶ 1稀釋，按50 μL/孔均勻鋪在Transwell小室上室，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置4～6 h待凝固。取對數(shù)生長期的IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞，按照“2.3.1”項下方法分組，并按“經(jīng)胰酶消化……0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉簽擦拭上室”等步驟同法操作。在光學顯微鏡下隨機挑選5個不同視野，拍照并計數(shù)跨膜細胞。

2.4 TET對NB細胞相關蛋白表達水平的影響考察

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞，按照“2.3.1”項下方法分組，經(jīng)胰酶消化，1 500 r/min離心15 min后以4.0×105個/mL接種于6孔板內(nèi)，待細胞貼壁后分別加入終濃度為0 μmol/L（正常對照組）、10 μmol/L（IMR-32細胞，TET組）或15 μmol/L（SH-SY5Y細胞，TET組）的TET甲醇溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。使用RIPA裂解液裂解并提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度以確定上樣濃度。所獲蛋白以上樣緩沖液×6作變性處理后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，110 V電壓轉(zhuǎn)膜；使用5%脫脂奶粉封閉1 h，加MMP-2抗體（1 ∶ 1 000）、MMP-9抗體（1 ∶ 1 000）、β-catenin抗體（1 ∶ 1 000）、GSK3β抗體（1 ∶ 1 000）、p-GSK3β抗體（1 ∶ 1 000）及β-actin抗體（1 ∶ 2 000），在4 ℃下?lián)u床孵育過夜；次日用TBST緩沖液漂洗10 min×3次，加入辣根過氧化酶標記抗體（二抗，1 ∶ 8 000），搖床上慢速常溫孵育1 h；TBST緩沖液漂洗10 min×3次，加入ECL試劑顯影。采用Quantity One 4.6.4分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白比較所得的相對灰度值表示目的蛋白表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 TET對NB細胞的細胞毒性

結(jié)果顯示，不同濃度的TET對IMR-32細胞和SH- SY5Y細胞的增殖均有抑制作用，并隨TET濃度增加該抑制作用有增強趨勢。與空白對照比較，當TET濃度為5～20 μmol/L時，細胞存活率隨著藥物濃度的增加而顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；TET對IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為10.148、14.461 μmol/L。根據(jù)IC50數(shù)據(jù)，并考慮到盡量減少藥物自身對腫瘤細胞的毒性作用，故后續(xù)實驗中TET對IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的處理濃度分別設為10、15 μmol/L。不同濃度TET作用后IMR-32細胞和SH-SY5Y 細胞的存活率見圖1。

3.2 TET對NB細胞遷移、侵襲能力的影響

3.2.1 細胞遷移實驗結(jié)果 細胞計數(shù)結(jié)果顯示，正常對照組 IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的跨膜數(shù)分別為（163.02±6.24）個、（118.13±7.50）個，TET組IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的跨膜數(shù)分別為（68.32±3.51）個、（61.24±5.03）個。與正常對照組比較，TET組跨膜細胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組NB細胞遷移實驗顯微圖見圖2，跨膜細胞數(shù)柱形圖見圖3。

3.2.2 細胞侵襲實驗結(jié)果 細胞計數(shù)結(jié)果顯示，正常對照組IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的跨膜數(shù)分別為（401.43±10.96）個、（182.28±5.56）個，TET組IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的跨膜數(shù)分別為（206.12±8.83）個、（83.35±3.60）個。與正常對照組比較，TET組跨膜細胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組NB細胞侵襲實驗顯微圖見圖4，跨膜細胞數(shù)柱形圖見圖5。

3.3 TET對NB細胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較，TET組IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組NB細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達電泳圖見圖6，蛋白表達水平柱形圖見圖7。

3.4 TET對NB細胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較，TET組IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；但各組間GSK3β的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組NB細胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達電泳圖見圖8，蛋白表達水平柱形圖見圖9。

4 討論

NB是兒童常見的惡性腫瘤疾病，嚴重威脅兒童生命健康。目前常用的手術、化療、放療、移植及生物治療等方法并不能有效控制疾病，因此積極尋找新的NB治療方法對于提高患者生存率、改善預后具有重要意義。粉防己作為傳統(tǒng)中藥具有悠久的藥用史，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，粉防己中的有效成分TET在體外和體內(nèi)均具有抗多種腫瘤的活性[11]。然而關于TET對NB的抗腫瘤作用卻研究甚少。本研究結(jié)果顯示，使用不同濃度的TET處理后，能明顯抑制IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞的增殖，且隨TET濃度增加該抑制作用呈增強趨勢；Transwell小室遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示，TET能顯著抑制NB細胞的遷移和侵襲能力。

MMPs家族在NB侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要功能。據(jù)文獻報道，MMPs是鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，能降解細胞外基質(zhì)中的蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵作用[12]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員，兩者均屬于明膠酶，能降解明膠和Ⅳ型膠原蛋白。在NB發(fā)生、發(fā)展過程中，MMP-2和MMP-9能促進NB的侵襲、遷移[13]。本研究結(jié)果顯示，TET處理能顯著降低IMR-32細胞和SH-SY5Y細胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體內(nèi)廣泛存在的信號傳導途徑，在NB發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其中β-catenin和GSK3β是該信號通路的關鍵調(diào)節(jié)分子[14]。當Wnt/β-catenin信號通路被激活時，無法形成降解復合物，因此無法降解β-catenin，從而使β-catenin能轉(zhuǎn)位進入細胞核，并與相應的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復合物，進而調(diào)節(jié)下游靶基因表達，引發(fā)細胞增殖分化、細胞侵襲轉(zhuǎn)移、組織形成等相應生理學改變；相反，當Wnt/β-catenin信號通路失活時，β-catenin被降解而無法發(fā)揮生物學功能[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關，中藥成分如姜黃素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移[17]。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，TET能抑制p-GSK3β和β-catenin的蛋白表達，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在TET抑制NB的遷移和侵襲過程中可能起到關鍵作用；但TET對GSK3β的蛋白表達未見明顯影響，這可能與GSK3β蛋白在不同狀態(tài)下磷酸化位點不同有關[18]。

綜上所述，TET能抑制NB細胞增殖及遷移、侵襲能力，而下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達水平和抑制Wnt/β-catenin信號通路是其可能的作用機制。

參考文獻

[ 1 ] CHEN X，ZHU Y，HAN L，et al. Chemokine receptor 4 gene silencing blocks neuroblastoma metastasis in vitro[J]. Neural Regen Res，2014，9（10）：1063-1067.

[ 2 ] 李雪.神經(jīng)母細胞瘤多藥耐藥機制的研究[J].國際兒科學雜志，2016，43（10）：748-753、759.

[ 3 ] 黃圓，蔣東海，范偉民.粉防己堿抗乳腺癌細胞株多藥耐藥的作用及抗氧化機制研究[J].中國婦幼保健，2017，32（11）：2469-2472.

[ 4 ] LIU W，KOU B，MA ZK，et al. Tetrandrine suppresses proliferation，induces apoptosis，and inhibits migration and invasion in human prostate cancer cells[J]. Asian J Androl，2015，17（5）：850-853.

[ 5 ] LAN J，WANG N，HUANG L，et al. Design and synthesis of novel tetrandrine derivatives as potential anti-tumor agents against human hepatocellular carcinoma[J]. Eur J Med Chem，2017. DOI：10.1016/j.ejmech.2017.01.008.

[ 6 ] LEI RR，HU HF，BAI F，et al. Anti-proliferative and apo- ptotic effects of S1，a tetrandrine derivative，in human gastric cancer BGC-823 cells[J]. Chin J Nat Med，2016，14（7）：527-533.

[ 7 ] ZHANG Y，LIU W，HE W，et al. Tetrandrine reverses epithelial-mesenchymal transition in bladder cancer by downregulating Gli-1[J]. Int J Oncol，2016，48（5）：2035-2042.

[ 8 ] CHEN S，LIU W，WANG K，et al. Tetrandrine inhibits migration and invasion of human renal cell carcinoma by regulating Akt/NF-kappaB/MMP-9 signaling[J]. PLoS One，2017，12（3）：e173725.

[ 9 ] WAN J，LIU T，MEI L，et al. Synergistic antitumour activity of sorafenib in combination with tetrandrine is mediated by reactive oxygen species（ROS）/Akt signaling[J]. Br J Cancer，2013，109（2）：342-350.

[10] XU W，DEBEB BG，LACERDA L，et al. Tetrandrine，a compound common in Chinese traditional medicine，pre- ferentially kills breast cancer tumor initiating cells（TICs）in vitro[J]. Cancers：Basel，2011，3（2）：2274-2285.

[11] BHAGYA N，CHANDRASHEKAR KR. Tetrandrine and cancer：an overview on the molecular approach[J]. Biomed Pharmacother，2018，97（116）：624-632.

[12] HUANG H，DU T，XU G，et al. Matrine suppresses invasion of castration-resistant prostate cancer cells by downregulating MMP-2/9 via NF-kappaB signaling pathway[J]. Int J Oncol，2017，50（2）：640-648.

[13] ARUMUGAM P，SUBRAMANIAN R，Priyadharsini JV，et al. Thymoquinone inhibits the migration of mouse neuroblastoma（Neuro-2a）cells by down-regulating MMP-2 and MMP-9[J]. Chin J Nat Med，2016，14（12）：904-912.

[14] ANGERS S，MOON RT. Proximal events in Wnt signal transduction[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（7）：468- 477.

[15] CLEVERS H，NUSSE R. Wnt/beta-catenin signaling and disease[J]. Cell，2012，149（6）：1192-1205.

[16] MACDONALD BT，TAMAI K，HE X. Wnt/beta-catenin signaling：components，mechanisms，and diseases[J]. Dev Cell，2009，17（1）：9-26.

[17] LU Y，WEI C，XI Z. Curcumin suppresses proliferation and invasion in non-small cell lung cancer by modulation of MTA1-mediated Wnt/beta-catenin pathway[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2014，50（9）：840-850.

[18] JAIN S，GHANGHAS P，RANA C，et al. Role of GSK-3β in regulation of canonical Wnt/β-catenin signaling and PI3-K/Akt oncogenic pathway in colon cancer[J]. Cancer Invest，2017，35（7）：473-483.

（收稿日期：2018-06-26 修回日期：2018-12-04）

（編輯：段思怡）