基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的白芍炒制前后化學(xué)成分研究

任娟 劉曉 李偉東 蔡皓 朱曉釵 蔡寶昌

摘要? 目的：采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法，探討白芍炒制前后化學(xué)成分的變化。方法：采用Agilent C18色譜柱，0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分別測定不同產(chǎn)地各10批生、炒白芍中的化學(xué)成分。結(jié)果：分別在生、炒白芍中鑒定出40種化學(xué)成分。結(jié)論：通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，為分析生、炒白芍中的化學(xué)成分提供一種快速、高效的分析方法，為綜合評價(jià)生白芍和炒白芍的質(zhì)量提供參考。

關(guān)鍵詞? 白芍;炒制;UHPLC-Q-TOF-MS/MS;四極桿;化學(xué)成分

Qualitative Analysis of Major Constituents of Raw and Processed Paeonia Lactiflora by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

Ren Juan1，2，Liu Xiao2，Li Weidong2，Cai Hao2，Zhu Xiaochai2，Cai Baochang2，3，4

（1 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210009，China; 2 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 Nanjing Haichang Chinese Medicine Corporation，Nanjing 210061，China）

Abstract Objective： By using ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，to investigate the changes of chemical composition in Paeonia lactiflora before and after progressed. Methods： Agilent C18 column，0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile gradient elution，volume flow rate 0.3 mL/min，tandem four-stage rod time-of-flight mass spectrometry were used to determine the chemical composition of 10 batches of raw and fried white peony in different producing areas. Results： A total of 40 chemical components were identified in raw Paeonia lactiflora （RPL） and processed Paeonia lactiflora （PPL）. Conclusion： UHPLC-Q-TOF-MS/MS technology provides a fast and efficient analytical method for the analysis of chemical constituents in RPL and PPL，which provides a reference for comprehensive evaluation of the quality of RPL and PPL.

Key Words? Paeonia lactiflora; Processing; UHPLC-Q-TOF-MS/MS; Quadrupole; Chemical components

中圖分類號：R932 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.003

白芍（ Cynanchum otophyllum） 為毛茛科植物芍藥（ Paeonia lactiflora? Pall.）的干燥根，氣微，味微苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效，用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、保肝等作用[2-4]。2015年版《中華人民共和國藥典》收載其飲片品種有白芍、炒白芍、酒白芍。白芍經(jīng)清炒后，以養(yǎng)血和營、斂陰止汗為主;經(jīng)酒炒后，降低酸寒伐肝之性，入血分，善于調(diào)經(jīng)止血，柔肝止痛[5]?，F(xiàn)代研究表明，白芍中的化學(xué)成分主要有單萜苷類、酚酸類、沒食子酰葡萄糖類、揮發(fā)油類等[6]，其中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和氧化芍藥苷等單萜苷類化合物被認(rèn)為是白芍的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[7-9]。2015年版《中華人民共和國藥典》通過測定芍藥苷含量對白芍進(jìn)行質(zhì)量控制，但是中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，測定單一成分難以反映飲片的整體質(zhì)量，高效分離能力的色譜與高分辨、高靈敏的質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)已在多組分中藥及復(fù)方成分定性分析中逐漸凸顯出獨(dú)特優(yōu)勢[10-12]。近年來針對白芍化學(xué)成分的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，但同時(shí)針對白芍和炒白芍中化學(xué)成分的研究尚少，故本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析白芍和炒白芍中的化學(xué)成分，為其質(zhì)量控制提供較全面的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP121S電子分析天平（梅特勒-托雷多公司）。日本Shimadzu超高效液相色譜儀（配有LC-30AD二元液相泵、SIL-30SD自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A5R在線脫氣機(jī)、CTO-30A柱溫箱）;美國AB SCIEX Triple TOF 5600+系統(tǒng)（配有電噴霧離子源ESI）;數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF1.6 software（ABSCEIX，USA）;數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Peakview 1.2 software（AB SCEIX，USA）;30A超高效液相色譜分析系統(tǒng)（日本，島津公司）;SPE固相萃取小柱。

1.2 試劑? 質(zhì)譜純甲酸、質(zhì)譜純甲醇、質(zhì)譜純乙腈（德國E.Merck）;水為Milliporeill-Q超純水，每日自制。

1.3 分析樣品 實(shí)驗(yàn)中所用10批生白芍和10批炒白芍樣品均購自醫(yī)院和藥店，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院副主任中藥師袁家財(cái)鑒定，為毛茛科植物芍藥（ Paeonia lactiflora Pall. ）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 UHPLC-Q-TOF-MS/MS色譜質(zhì)譜條件 色譜條件：采用Agilent C18反向色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相A（0.1%甲酸水）-B（乙腈），梯度洗脫，程序?yàn)?～2 min，5% ～13% B;2～12 min，13% ～19% B;12～15 min，19% ～33% B;15～18 min，33% ～55% B;18～22 min，55% ～100% B;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜條件：Q-TOF-MS/MS系統(tǒng)使用ESI離子源，分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。ISVF為4 500/-4 500 V，TEM為550 ℃，DP為60/-60 V，CE為35/-35 eV，霧化氣體為氮?dú)?，Gas1為55 psi（1 psi≈6.9 kPa），Gas2為55 psi，Curtain Gas為35 psi。 一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為 m/z? 100～2 000，二級質(zhì)譜子離子掃描范圍為 m/z? 50～1 000，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

2.2 供試品溶液的制備 取白芍及炒白芍粉（60目）各0.5 g，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液35 mL，超聲提取30 min，取出，用50%甲醇溶液定容。取1.5 mL溶液置2 mL離心管，13 000 r/min離心5 min，精密移取1 mL上清液過SPE柱，梯度洗脫：10%甲醇1 mL，30%甲醇2 mL，50%甲醇3 mL，70%甲醇2 mL，100%甲醇1 mL，合并洗脫液，取1.5 mL洗脫液置2 mL離心管，13 000 r/min離心5 min，取上清液即得。

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立 借助于CNKI、PubMed和SciFinder等數(shù)據(jù)庫檢索白芍相關(guān)文獻(xiàn)，盡可能全面地建立包含中藥白芍中所含化合物的分子式、分子質(zhì)量和化學(xué)名稱等信息數(shù)據(jù)庫，并借助于ChemSpider、ChemicalBook等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載各個(gè)化合物的mol文件，計(jì)算其在正離子模式下常見離子[M+H]+、[M+NH4]+和負(fù)離子模式下常見離子[M+COOH]-、[M-H]-等多種離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比數(shù)值[16-18]。

2.4 軟件應(yīng)用? 將白芍生品和炒品的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView軟件中，通過分析比較各個(gè)化合物由總離子流圖提取到的一級質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)比對以及二級碎片與其mol文件所對應(yīng)的碎片之間的匹配進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn)，最終質(zhì)量數(shù)誤差5 ppm以內(nèi)、結(jié)構(gòu)匹配度達(dá)到80%以上的成分被鑒定出來。

2.5 成分鑒別和分析 白芍生品和炒品在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖。見圖1。正、負(fù)離子2種模式下共鑒別出40種化合物。見表1。以芍藥苷為例來說明鑒別過程，峰17的[M-H]-為479.155 89，對應(yīng)分子式為C23H28O11，質(zhì)量數(shù)為480.163 16，主要二級碎片為 m/z? 121.030 8，327.108 1，479.179 7，77.042 9，與文獻(xiàn)報(bào)道芍藥苷的二級質(zhì)譜碎片離子相一致，推測該化合物為芍藥苷，將芍藥苷的mol文件所預(yù)測的碎片與二級碎片進(jìn)行匹配，最終確認(rèn)該化合物為芍藥苷。其他化合物采用類似鑒定方法，分別于生、炒白芍中鑒定出來40種成分，其化學(xué)種類主要是單萜苷類和酚酸類成分，從成分種類來看，白芍炒制前后沒有質(zhì)變成分。

3 討論

供試品溶液制備時(shí)，考察了不同濃度甲醇作為提取溶劑，結(jié)果顯示50%的濃度下，白芍TIC圖譜上的峰較多，提取比較完全，又考察了分別用甲醇和乙醇作為提取液，發(fā)現(xiàn)甲醇提取峰形更好，所以選擇用50%甲醇做提取溶劑。

白芍清炒后，藥性緩和，藥效偏于柔肝、和脾、止瀉。本實(shí)驗(yàn)對炮制前后的化學(xué)成分進(jìn)行研究，鑒定出的40種成分在生品和炮制品中種類未見顯著性差異，白芍炒后藥性緩和，可能是因?yàn)槌粗坪笥行С煞值暮堪l(fā)生了變化，有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過數(shù)據(jù)庫匹配及二級結(jié)構(gòu)分析，參考相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了白芍和炒白芍中40種化學(xué)成分。該方法快速、簡便、靈敏度高，可為白芍及其炮制品后續(xù)的化學(xué)成分研究、藥理研究以及質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

[2]賀妮，侯宇，柏慧，等.白芍提取物抗抑郁及抗炎作用的研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，13（3）：348-352.

[3]段文娟，李月，楊國紅，等.白芍對斑馬魚促血管生成和抗血栓作用的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2018，29（4）：834-837.

[4]左志燕，詹淑玉，黃嬛，等.白芍總苷保肝作用的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2017，41（20）：22-27.

[5]蔡寶昌.中藥炮制學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：167.

[6]譚淑瑜，肖雪，樸勝華，等.白芍水溶性成分快速鑒定研究[J].中藥材，2017，40（1）：94-100.

[7]Cao W J，Zhang W，Liu J J.Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-alpha and IL-1 beta release and augmentation of IL-10 production[J].International Immunopharmacology，2010，11（2）：172-178.

[8]Wang Q S，Gao T，Cui Y L，et al.Comparative studies of paeoniflorin and albiflorin fromPaeonia lactiflora on anti-inflammatory activities[J].Pharmaceutical Biology，2014，52（9）：1189-1195.

[9]Yen，Pham Hai，et al.A new monoterpene glycoside from the roots ofPaeonia lacti-flora increases the differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cell[J].Archives of Pharmacal Research，2007，30（10）：1179-1185.

[10] 陶益.地黃炮制前后化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF/MS比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（1）：102-106.

[11]陳堅(jiān)平，鐘艷梅，余楚欽，等.UHPLC-Q-TOF-MS法分析蒿甲虛熱清顆粒的化學(xué)成分[J].中藥材，2017，40（6）：1368-1372.

[12]王志成，季雪，崔韶婧，等.基于超高效液相色譜-四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的通脈顆粒質(zhì)量評價(jià)研究[J].藥物評價(jià)研究，2016，39（4）：603-607.

[13]童黃錦，白發(fā)平，汪小莉，等.不同產(chǎn)地白芍藥材的指紋圖譜研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（9）：1326-1329.

[14]翁金月，曹崗，吳鑫，等.基于多指標(biāo)成分的白芍麩炒前后特征指紋圖譜比較研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（5）：1056-1057.

[15]梁德勤，趙園園，羅云，等.不同加工方式亳白芍的高效液相指紋圖譜及多成分含量比較[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，37（2）：85-89.

[16]周海玲，許舜軍，周若龍，等.白芍、赤芍化學(xué)成分的高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析[J].中藥材，2018，41（7）：1638-1641.

[17]練杭蕓，徐王彥君，梁乾德，等.UPLC-QTOF MS法比較赤芍、白芍煎液化學(xué)成分差異[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，35（3）：269-278.

[18]Minxia Z，Zhe C，Pei L，et al.Analysis and identification of glycosides in Paeonia lactiflora by UPLC-MS/MS[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2011，36（12）：1641-1643.