• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    原阿片堿對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2增殖的抑制作用及機(jī)制研究

    2019-09-10 07:00:00吳新玉李靖張金娟廖尚高梅青吳亞云席曉嵐
    中國藥房 2019年23期
    關(guān)鍵詞:增殖凋亡機(jī)制

    吳新玉 李靖 張金娟 廖尚高 梅青 吳亞云 席曉嵐

    中圖分類號(hào) R361+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2019)23-3210-06

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.08

    摘 要 目的:考察原阿片堿對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2增殖的抑制作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:采用MTT法測定25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿作用24 h對(duì)HSC-LX2細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。另取HSC-LX2細(xì)胞分為對(duì)照組(含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基)和原阿片堿低、中、高濃度組(100、200、400 μmol/L),作用24 h后,流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率;熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法測定細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、組織金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1) mRNA的相對(duì)表達(dá)量,Western blot法測定細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿對(duì)HSC- LX2細(xì)胞的增殖抑制率分別為0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。與對(duì)照組比較,原阿片堿低、中、高濃度組細(xì)胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);原阿片堿中、高濃度組細(xì)胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高,α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相對(duì)表達(dá)量和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論:原阿片堿可抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,可降低α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1表達(dá),升高M(jìn)MP-2表達(dá)有關(guān)。

    關(guān)鍵詞 原阿片堿;肝星狀細(xì)胞HSC-LX2;增殖;凋亡;機(jī)制

    Inhibitory Effects of Protopine on the Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells HSC-LX2 and Its Mechanism Study

    WU Xinyu1,2,LI Jing1,2,ZHANG Jinjuan3,LIAO Shanggao1,2,MEI Qing1,2,WU Yayun4,XI Xiaolan1,2(1.School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guizhou Guian New Area 550025, China;2.National Engineering Research Center of Miaos Medicines & Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Ministry of Education, Guiyang 550004, China;3.School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guizhou Guian New Area 550025, China;4.Dept. of Infectious Diseases, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

    ABSTRACT ? OBJECTIVE: To investigate inhibitory effects of protopine on the proliferation of human hepatic stellate cells HSC-LX2 and to explore its mechanism preliminarily. METHODS: MTT assay was used to detect the effects of 25, 50, 100, 200, 400 and 500 μmol/L protopine on the proliferation of HSC-LX2 cells. The inhibitory effect of cell proliferation was calculated. HSC-LX2 cells were divided into control group (1640 medium containing 5% fetal bovine serum), protopine low-concentration, medium-concentration and high-concentration groups (100, 200, 400 μmol/L). After treated for 24 h. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of α-SMA, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ, MMP-2 and TIMP-1 in cells. The protein expressions of α-SMA, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ and MMP-2 were detected by Western blot. RESULTS: The inhibitory rates of 25, 50, 100, 200, 400 and 500 μmol/L protopine on proliferation HSC-LX2 cells were 0, 6.9%, 18.7%, 34.2%, 48.9%, 53.9%, respectively. Compared with control group, mRNA expression of Collagen Ⅰ, TIMP-1 and protein expression of α-SMA were decreased significantly in protopine low-concentration, medium-concentration and high-concentration groups, while protein expression of MMP- 2 was increased significantly, with statistical significance (P<0.05 or P<0.01). Apoptotic rate of HSC-LX2 cells and mRNA expression of MMP-2 were increased significantly in protopine medium-concentration and high-concentration groups, mRNA expression of α-SMA and Collagen Ⅲ, protein expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were decreased significantly, with statistical significance (P<0.05 or P<0.01). CONCLUSIONS: Protopine can induce the apoptosis of HSC-LX2 cells and inhibit their cell proliferation, and reduce the expression of a-SMA, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ and TIMP-1, and increase the expression of MMP-2.

    KEYWORDS ? Protopine; Hepatic stellate cells HSC-LX2; Proliferation; Apoptosis; Mechanism

    肝纖維化(Hepatic fibrosis)是指肝實(shí)質(zhì)損傷后修復(fù)時(shí)通過形成瘢痕取代受損或破壞的肝組織,其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的合成與降解失衡,致使肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。肝纖維化不是一個(gè)獨(dú)立的疾病,也不是一個(gè)獨(dú)立的診斷,而是許多慢性肝病發(fā)展的共同病理生理過程[1]。有研究表明,肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)激活變成肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化的主要來源[2],是合成和分泌ECM并可產(chǎn)生膠原酶的一種肝間質(zhì)細(xì)胞[3],在肝纖維化形成的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。在肝損傷時(shí),各種因素刺激導(dǎo)致HSCs從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài),其特征在于α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的過表達(dá)[5];通過自分泌或者旁分泌激活的HSCs增殖;以Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅲ為主的ECM過多沉積,最終形成肝纖維化[6]?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種能降解ECM的酶,在靜止的HSCs中,MMPs和組織金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)處于一種動(dòng)態(tài)平衡,發(fā)生肝纖維化時(shí)平衡會(huì)被打破,TIMP-1被激活,MMP-2的活性被抑制[7-9],從而影響ECM的穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致肝纖維化。發(fā)生肝纖維化時(shí),HSCs的數(shù)量顯著增多,主要原因固然是因?yàn)槠浼せ罴霸鲋乘?,但其凋亡的相?duì)不足也可能是一個(gè)重要因素。

    苗藥“消疤草”(苗語稱Vob hxenk dliangd)是貴州省黔東南苗族民間用于治療瘢痕的單味藥,能使明顯凸出皮膚表面的瘢痕疙瘩明顯縮小、變平。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),“消疤草”對(duì)大鼠免疫性肝纖維化具有很好的預(yù)防作用,并表現(xiàn)出抑制ECM形成的作用[10-12]。但“消疤草”中發(fā)揮抗肝纖維化作用的活性成分尚不清楚,作用機(jī)制亦不明確。本課題組在前期的藥效研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確了原阿片堿(Protopine)、Macleayin E、β?卡波林、2-(4-羥基-3-甲氧苯基)-3-[N-2-(4-羥基苯基)乙基]氨基甲酰-5-[N-2-(4-羥基苯基)乙基]氨基甲酰乙烯基-7-甲氧基苯并二氫呋喃等4個(gè)單體可能是“消疤草”抗肝纖維化的有效成分[13]。原阿片堿是一種異喹啉類生物堿[14-15],分子式為C20H19NO5?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,原阿片堿具有鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、松弛平滑肌、抗心律失常、抗腫瘤、抗肝損傷、抗膽堿酯酶等活性[16-17],但其對(duì)HSCs和肝纖維化的影響目前尚不清楚。本研究擬通過考察原阿片堿對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2增殖的影響,初步探討其對(duì)肝纖維化的作用,并從分子機(jī)制上探討其可能的作用機(jī)制。原阿片堿的結(jié)構(gòu)式見圖1。

    1 材料

    1.1 儀器

    2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、902型-80 ℃冰箱(美國 Thermo Fisher Scientific公司);全波段多功能酶標(biāo)儀、Universal HoodⅡ型成像分析儀(美國Bio-Tek公司);PHS-25型數(shù)顯臺(tái)式pH計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司);CP124C型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司];Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司);BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司);TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Promo Vert型倒置顯微鏡[成貫儀器(上海)有限公司];SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);LDZX-50FBS型滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司);K30型干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司);Step One PlusTM型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國Applied Biosystems公司);XH-B型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)。

    1.2 藥品與試劑

    原阿片堿由廖尚高教授課題組提供,高效液相色譜法(HPLC)和核磁共振檢測純度均在95%以上;磷酸鹽緩沖液(PBS粉末,無錫傲銳東源生物科技有限公司,自配,pH 7.2~7.4,質(zhì)量濃度:11.74 μg/mL);RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司,批號(hào):8117293、1967534);胎牛血清(美國ScienCell公司,批號(hào):23954);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、二甲基亞砜(DMSO,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))、MTT試劑、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20180913、20180328、20180327、1213C0342、804W054、20180619);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號(hào):Apr-23D)、一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):061218181026、091018181015);磷脂結(jié)合蛋白(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司,批號(hào):20180906);Trizol試劑(美國Ambion Life Technologies公司,批號(hào):101002);RNA提取試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司,批號(hào):50250);PCR擴(kuò)增試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,批號(hào):7E220E8);免疫印跡化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(美國Millipore公司,批號(hào):1722101);α-SMA兔單克隆抗體、Collagen Ⅲ兔單克隆抗體、MMP-2兔單克隆抗體(美國Abcam公司,批號(hào):5368、17673、1184);Collagen Ⅰ兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號(hào):10423R);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國Affinity公司,批號(hào):S0001、AF7021);甲醇、乙醇、DMSO(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分析純);水為雙蒸水;α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.3 細(xì)胞

    HSC-LX2細(xì)胞購自美國Millipore公司。

    2 方法

    2.1 原阿片堿溶液的制備

    用DMSO溶解原阿片堿,制成濃度為 100 mmol/L 的母溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用),0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    HSC-LX2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清及100 u/mL 青霉素和100 μg /mL鏈霉素的1640高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24 h換一次液,待細(xì)胞融合至80%~90%時(shí)傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

    2.3 MTT法檢測HSC-LX2細(xì)胞的增殖抑制率

    取對(duì)數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞,以0.2 %胰蛋白酶消化,以離心半徑4 cm(下同)、1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,以5×104 mL-1的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 ?μL,邊緣用200 μL 無菌的PBS填充以防干燥,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置貼壁。再將HSC-LX2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、DMSO組和不同濃度的原阿片堿組(25、50、100、200、400、500 μmol/L),每組6個(gè)復(fù)孔。輕輕吸棄原培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,對(duì)照組加入含5%胎牛血清1640培養(yǎng)基100 μL,DMSO組加入含5‰DMSO的1640培養(yǎng)基100 μL,原阿片堿組分別加入25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿的含5%胎牛血清1640培養(yǎng)基100 μL。藥物作用24 h后,每孔分別避光加入5%MTT溶液10 μL,輕微混勻后,于37 ℃下繼續(xù)孵育4 h,輕輕棄盡孔中溶液,每孔加入150 μL的DMSO,搖床振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處的光密度(OD),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)= [1-(給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD 值)]×100%。

    2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-LX2細(xì)胞的凋亡率

    取對(duì)數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞,以0.25%胰酶消化,以1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,以7×104 mL-1的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1 mL,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置貼壁。再將HSC-LX2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和原阿片堿低、中、高濃度組,每組3個(gè)復(fù)孔。輕輕吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,對(duì)照組加入含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基1 mL,原阿片堿低、中、高濃度組加入100、200、400 μmol/L原阿片堿的含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基1 mL。藥物作用24 h后,收集細(xì)胞上清,用PBS洗1次,用不含EDTA的胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,用PBS洗2次(2 000 r/min離心5 min),加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書標(biāo)記細(xì)胞,處理后待機(jī)上樣,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

    2.5 RT-PCR法檢測HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

    取對(duì)數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞,按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)、分組和加藥,每孔2 mL。藥物作用24 h后,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA用于合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因,分別對(duì)α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP- 2、TIMP-1進(jìn)行擴(kuò)增,測定RNA的量及純度。PCR反應(yīng)體積為20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線(65~95 ℃),采用2-ΔΔct相對(duì)定量法[18]計(jì)算α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

    2.6 Western blot 法檢測HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

    取對(duì)數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞,按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)、分組和加藥,每孔8 mL。藥物作用24 h后,加預(yù)冷后的PBS洗滌1次,加RIPA 蛋白裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑)后于冰盒上搖晃裂解離心提取上清液,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取蛋白上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行定量[19]。加入5×蛋白上樣緩沖液,于100 ℃加熱5 min變性,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉將膜封閉1.5 h,TBST緩沖液清洗3次,每次10 min,分別加入一抗[GAPDH(1 ∶ 3 000)、α-SMA兔單克隆抗體(1 ∶ 10 000)、CollagenⅠ兔多克隆抗體(1 ∶ 1 000)、Collagen Ⅲ 兔單克隆抗體(1 ∶ 1 000)、MMP-2兔單克隆抗體(1 ∶ 1 000)]孵育,4 ℃冷藏過夜。第2天PVDF膜室溫孵育15 min后,用TBST緩沖液清洗3次,每次10 min,與相應(yīng)二抗[HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶ 5 000)]室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,用ECL發(fā)光試劑盒顯影,以Image J 1.8.0 軟件分析條帶的灰度值,以目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值評(píng)價(jià)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)采用x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析或Dunnetts t檢驗(yàn),兩組樣本均值之間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 細(xì)胞增殖抑制率

    與對(duì)照組比較,DMSO組細(xì)胞的OD值無明顯變化(P>0.05),50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿組細(xì)胞的OD值均明顯減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。隨著原阿片堿濃度的增加,細(xì)胞的OD值逐漸減小。各組HSC-LX2細(xì)胞增殖抑制率的結(jié)果見表2。

    3.2 細(xì)胞凋亡率

    與對(duì)照組比較,中、高濃度原阿片堿組細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組HSC- LX2細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖見圖2,細(xì)胞凋亡率的結(jié)果見表3。

    3.3 細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達(dá)

    與對(duì)照組比較,原阿片堿低、中、高濃度組細(xì)胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低;原阿片堿中、高濃度組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低,MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。各組HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果見表4。

    3.4 細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達(dá)

    與對(duì)照組比較,原阿片堿低、中、高濃度組細(xì)胞中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,MMP-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng);原阿片堿中、高濃度組細(xì)胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。各組HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3,蛋白相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果見表5。

    4 討論

    肝纖維化是一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性的肝病理生理現(xiàn)象,屬可逆病變。近年來的研究發(fā)現(xiàn),盡管不同病因?qū)е赂卫w維化的機(jī)制不同,但均具有一個(gè)共同點(diǎn),即都有HSCs的參與,HSCs是纖維化反應(yīng)的重要效應(yīng)器和細(xì)胞因子的主要來源和靶點(diǎn)[20]。

    本研究探討了原阿片堿對(duì)HSC-LX2細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著原阿片堿作用濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加。說明原阿片堿對(duì)HSC-LX2細(xì)胞有增殖抑制作用和促凋亡作用。HSCs在正常情況下處于靜息狀態(tài),不表達(dá)α-SMA,因此,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中,α-SMA的表達(dá)被認(rèn)為是HSCs激活的指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示,原阿片堿處理后顯著降低了HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá),表明原阿片堿對(duì)HSC-LX2細(xì)胞的活化具有抑制作用。HSCs活化后向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變,可分泌大量ECM成分,包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等,同時(shí)大量合成、分泌TIMPs,抑制MMPs活性,從而抑制ECM的降解,造成ECM產(chǎn)生與降解失衡,最終導(dǎo)致肝纖維化形成[22-26]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)原阿片堿處理后,HSC-LX2細(xì)胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA及蛋白的表達(dá)降低,MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)增強(qiáng),TIMP-1 mRNA的表達(dá)降低,表明TIMP-1對(duì)MMPs的抑制得到改善,使得ECM的生成減少,降解增多。提示抑制HSCs的增殖和對(duì)HSCs中ECM的降解可能是通過MMP-2、 TIMP-1的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。但本研究尚無確切的證據(jù)證明原阿片堿對(duì)TIMP-1蛋白表達(dá)有影響,對(duì)于這個(gè)問題后期將繼續(xù)探討。

    原阿片堿是從“消疤草”里分出來的單體化合物,本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)HSC-LX2細(xì)胞有增殖抑制作用,提示“消疤草”發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥用成分中可能有原阿片堿,此發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床上治療肝纖維也有一定的參考意義。

    參考文獻(xiàn)

    [ 1 ] DUVAL F,MORENO-CUEVAS JE,GONZALEZ-GARZA MT,et al. Liver fibrosis and mechanisms of the protective action of medicinal plants targeting inflammation and the immune response[J]. Int J Inflam,2015,20(5):943- 957.

    [ 2 ] 楊小瑜.肝纖維化的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2017,57(11):108-110.

    [ 3 ] SENOO H,YOSHIKAWA K,MORII M,et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative:past,present and future[J]. Cell Biol Int,2010,34(12):1247- 1272.

    [ 4 ] 高強(qiáng),李旭光,樊莉,等.肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017,17(14):2780-2785.

    [ 5 ] 唐勤彩,羅和生.大蒜素對(duì)肝纖維化防治作用研究進(jìn)展[J].臨床內(nèi)科雜志,2018,35(2):138-140.

    [ 6 ] WEI S,NIU M,WANG J,et al. A network pharmacology approach to discover active compounds and action mechanisms of San-cao granule for treatment of liver fibrosis[J]. Drug Des Devel Ther,2016.DOI:10.2147/DDDT.S96964.

    [ 7 ] BOON L,UGARTE-BERZAL E,VANDOOREN J,et al. Glycosylation of matrix metalloproteases and tissue inhibitors:present state,challenges and opportunities[J]. Biochem J,2016,473(11):1471-1482.

    [ 8 ] ROHANI MG,PARKS WC. Matrix remodeling by MMPs during wound repair[J]. Matrix Biol,2015.DOI:10.1016/j.matbio.2015.03.002.

    [ 9 ] 穆華,張哲,梁傳棟,等.卡維地洛對(duì)瘦素誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞活化增殖的影響及機(jī)制研究[J].中國藥房,2017,28(19):2620-2624.

    [10] 吳亞云,李惠,熊濤,等.消瘢方預(yù)防豬血清免疫性肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(10):974-976.

    [11] 吳亞云,程明亮,李宏,等.消瘢方對(duì)體外CCl4損傷大鼠原代肝細(xì)胞保護(hù)作用的研究[J].世界華人消化雜志,2005,13(9):1139-1141.

    [12] 龍歷.貴州苗藥“消疤草”預(yù)防肝纖維化及作用機(jī)理研究[D].貴安新區(qū):貴州醫(yī)科大學(xué),2016.

    [13] 梅青,廖尚高,周翠瓊,等.苗藥消疤草抗肝纖維化活性成分研究[J].中藥材,2019,42(8):1801-1805.

    [14] 鄭建芳,秦民堅(jiān).紫堇屬植物生物堿類化學(xué)成分與藥理作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2007,22(2):55-59.

    [15] 陳荃,王廷璞,趙蘭蘭,等.紅茂草藥理作用與人工栽培技術(shù)研究進(jìn)展[J].天水師范學(xué)院學(xué)報(bào),2008,28(2):49-52.

    [16] 鄧敏,王家富.普洛托品的藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2001,32(3):275-277.

    [17] 李艷紅.原阿片堿的臨床應(yīng)用分析[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘(電子版),2014,14(9):113.

    [18] SCHMITTGEN TD,LIVAK KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C (T) method[J]. Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

    [19] 韓富亮,袁春龍,郭安鵲,等.二喹啉甲酸法(BCA)分析蛋白多肽的原理、影響因素和優(yōu)點(diǎn)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(11):202-207.

    [20] 胡燁,張國.肝纖維化的藥物治療研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志,2016,19(1):8-11.

    [21] 韋淇元,唐秀能,黃仁彬.中草藥黃酮類化合物治療肝纖維化分子信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J].中國藥房,2019,30(6):842-846.

    [22] CHEN RJ,WU HH,WANG YJ. Strategies to prevent and reverse liver fibrosis in humans and laboratory animals[J]. Arch Toxicol,2015,89(10):1727-1750.

    [23] 杜航航,張恒術(shù).秋水仙堿對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-2表達(dá)的影響[J].中國燒傷創(chuàng)瘍雜志,2018,30(1):48-54.

    [24] 曹媛,夏延哲,陳杰,等.五味子甲素在人肝星狀細(xì)胞中的抗纖維化作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2016,21(8):878-883.

    [25] 譚勤銳,李暉,楊琪,等.基質(zhì)金屬蛋白酶及其特定抑制劑在肝纖維化形成中的作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2017,57(34):115-117.

    [26] WANG F,LIU S,DU T,et al. NF-κB inhibition alleviates carbon tetrachloride-induced liver fibrosis via suppression of activated hepatic stellate cell[J]. Exp Ther Med,2014,8(1):95-99.

    (收稿日期:2019-08-06 修回日期:2019-10-18)

    (編輯:鄒麗娟)

    猜你喜歡
    增殖凋亡機(jī)制
    自制力是一種很好的篩選機(jī)制
    文苑(2018年21期)2018-11-09 01:23:06
    ‘金凱特’杏的組織培養(yǎng)與快繁
    普伐他汀對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990的影響及其協(xié)同吉西他濱的抑瘤作用
    細(xì)胞自噬與人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的關(guān)系
    Livin和Survivin在卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究
    雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響
    科技視界(2016年5期)2016-02-22 19:03:28
    破除舊機(jī)制要分步推進(jìn)
    注重機(jī)制的相互配合
    打基礎(chǔ) 抓機(jī)制 顯成效
    中國火炬(2014年4期)2014-07-24 14:22:19
    国产三级黄色录像| 母亲3免费完整高清在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 久久香蕉国产精品| 最近在线观看免费完整版| 国产精品永久免费网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久香蕉国产精品| bbb黄色大片| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美黄色片欧美黄色片| 一级片免费观看大全| 欧美3d第一页| 国产精品野战在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 丁香欧美五月| 十八禁网站免费在线| 视频区欧美日本亚洲| 日本a在线网址| 成人av在线播放网站| 最新美女视频免费是黄的| 国内精品一区二区在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 人成视频在线观看免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美三级亚洲精品| 五月玫瑰六月丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产欧美网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲成av人片免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 妹子高潮喷水视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲欧美日韩高清专用| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲九九香蕉| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产激情欧美一区二区| 男人舔女人的私密视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 热99re8久久精品国产| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 岛国视频午夜一区免费看| 在线观看午夜福利视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av美国av| 国产av又大| 久久热在线av| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲专区中文字幕在线| 黄色视频不卡| 可以在线观看的亚洲视频| 黄色a级毛片大全视频| 小说图片视频综合网站| 国产成年人精品一区二区| 1024视频免费在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产私拍福利视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩欧美精品v在线| 啦啦啦免费观看视频1| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久99热这里只有精品18| 在线永久观看黄色视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲激情在线av| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 久久久久久大精品| 免费看美女性在线毛片视频| 免费看美女性在线毛片视频| av视频在线观看入口| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人av在线播放网站| 最新在线观看一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 最新美女视频免费是黄的| 成人欧美大片| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜精品在线福利| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩免费av在线播放| 哪里可以看免费的av片| 国产区一区二久久| 婷婷亚洲欧美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美日韩一级在线毛片| 在线国产一区二区在线| av国产免费在线观看| 亚洲av熟女| 校园春色视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美黑人精品巨大| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 白带黄色成豆腐渣| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲五月天丁香| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 99热只有精品国产| 一级作爱视频免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 日本成人三级电影网站| 欧美大码av| 午夜免费激情av| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久久久精品国产欧美久久久| 日日夜夜操网爽| 国产精品免费视频内射| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产成人精品无人区| а√天堂www在线а√下载| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜免费观看网址| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产高清视频在线观看网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 日本 欧美在线| 亚洲人与动物交配视频| 欧美极品一区二区三区四区| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产看品久久| av在线天堂中文字幕| www.www免费av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美在线乱码| 国产亚洲精品一区二区www| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美三级亚洲精品| 亚洲美女黄片视频| 国产高清激情床上av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 黄频高清免费视频| 午夜精品在线福利| 成人亚洲精品av一区二区| 窝窝影院91人妻| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 曰老女人黄片| 午夜免费激情av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产一区二区三区视频了| 麻豆国产97在线/欧美 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 黄片小视频在线播放| 久久久国产成人免费| 人人妻人人看人人澡| 精品人妻1区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久久精品国产欧美久久久| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产成人精品久久二区二区免费| avwww免费| 久久久久九九精品影院| 免费在线观看日本一区| 午夜a级毛片| 亚洲欧美日韩高清专用| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| www日本黄色视频网| 日韩大码丰满熟妇| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产精品久久视频播放| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美高清成人免费视频www| 欧美成人午夜精品| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 欧美日本视频| 国产免费av片在线观看野外av| 成人av在线播放网站| 超碰成人久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 哪里可以看免费的av片| 国产精品久久电影中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 两个人的视频大全免费| 久久99热这里只有精品18| 天天添夜夜摸| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 91在线观看av| 亚洲国产看品久久| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品影院6| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩精品中文字幕看吧| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成年人精品一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品美女久久av网站| 最新在线观看一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 免费观看人在逋| 亚洲第一电影网av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩有码中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| or卡值多少钱| www.熟女人妻精品国产| 国产精品亚洲一级av第二区| 88av欧美| 热99re8久久精品国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲电影在线观看av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一本精品99久久精品77| 日本熟妇午夜| 变态另类丝袜制服| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 淫妇啪啪啪对白视频| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲黑人精品在线| 午夜a级毛片| 午夜福利免费观看在线| 最新在线观看一区二区三区| 在线a可以看的网站| 免费电影在线观看免费观看| 大型av网站在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一区二区三区国产精品乱码| 手机成人av网站| 色在线成人网| 亚洲av电影在线进入| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91av网站免费观看| 国产日本99.免费观看| 国产激情欧美一区二区| 999久久久国产精品视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 国产久久久一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲自拍偷在线| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美zozozo另类| aaaaa片日本免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 草草在线视频免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 999精品在线视频| 亚洲av成人av| 在线观看日韩欧美| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品福利观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日日爽夜夜爽网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产片内射在线| 国产在线观看jvid| 久久久久性生活片| 日韩欧美 国产精品| 国产精品 国内视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品电影一区二区在线| 两性夫妻黄色片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜福利免费观看在线| 一级毛片精品| 亚洲,欧美精品.| 日本三级黄在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲欧美激情综合另类| 两个人的视频大全免费| 桃红色精品国产亚洲av| 免费无遮挡裸体视频| 嫩草影院精品99| 国产成人av激情在线播放| 久久人人精品亚洲av| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久九九热精品免费| 亚洲avbb在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一a级毛片在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品电影一区二区三区| av天堂在线播放| 麻豆av在线久日| 九色国产91popny在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 90打野战视频偷拍视频| www国产在线视频色| 国产乱人伦免费视频| 亚洲av美国av| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久中文字幕一级| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲真实伦在线观看| 无人区码免费观看不卡| 亚洲 国产 在线| 久久久国产成人免费| 国产99白浆流出| 久久性视频一级片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲五月天丁香| 岛国在线观看网站| 黄频高清免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久中文字幕人妻熟女| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99国产精品99久久久久| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲精品色激情综合| 欧美大码av| 两个人免费观看高清视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线视频色国产色| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲精品在线观看二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线视频色国产色| 婷婷丁香在线五月| 一级a爱片免费观看的视频| www国产在线视频色| 最好的美女福利视频网| 99久久精品国产亚洲精品| 国产爱豆传媒在线观看 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 18禁观看日本| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久久九九精品二区国产 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 成人av一区二区三区在线看| 午夜精品在线福利| 成人av一区二区三区在线看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲中文字幕日韩| 又大又爽又粗| 精品国产亚洲在线| 亚洲成av人片免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久国内视频| 亚洲精品在线美女| 黄片大片在线免费观看| 悠悠久久av| 一个人免费在线观看电影 | 一本精品99久久精品77| 午夜福利18| 黄片大片在线免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲成人免费电影在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日本亚洲视频在线播放| 三级毛片av免费| 18禁观看日本| 99久久精品国产亚洲精品| 国产av在哪里看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| www.自偷自拍.com| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成人系列免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜激情福利司机影院| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲中文av在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99国产精品99久久久久| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日本五十路高清| e午夜精品久久久久久久| 久久人人精品亚洲av| 国产成人欧美在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 在线播放国产精品三级| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人欧美大片| 嫩草影院精品99| 成人永久免费在线观看视频| 69av精品久久久久久| 激情在线观看视频在线高清| 久久久久国内视频| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲美女视频黄频| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一本综合久久免费| 人成视频在线观看免费观看| 欧美日韩黄片免| x7x7x7水蜜桃| 午夜a级毛片| 久久久久久久久免费视频了| 舔av片在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 男人舔女人的私密视频| 老司机福利观看| 黄片小视频在线播放| 麻豆一二三区av精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜两性在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| avwww免费| 久久久精品大字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 精品不卡国产一区二区三区| 久99久视频精品免费| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人啪精品午夜网站| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 极品教师在线免费播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 后天国语完整版免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 青草久久国产| 日本五十路高清| 日韩欧美在线二视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| netflix在线观看网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 妹子高潮喷水视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产高清激情床上av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成在线人永久免费视频| 亚洲最大成人中文| 十八禁网站免费在线| 久久久国产精品麻豆| 欧美又色又爽又黄视频| 中国美女看黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产99白浆流出| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜福利免费观看在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美不卡视频在线免费观看 | 91老司机精品| 亚洲,欧美精品.| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品九九99| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 香蕉国产在线看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 99热只有精品国产| 久久人妻av系列| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲av片天天在线观看| 1024视频免费在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲色图av天堂| 制服诱惑二区| www日本黄色视频网| 欧美一级毛片孕妇| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成人av在线播放网站| 男人舔女人的私密视频| 日本在线视频免费播放| 欧美午夜高清在线| 亚洲av成人一区二区三| a级毛片a级免费在线| 国产乱人伦免费视频| 免费搜索国产男女视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人国产一区在线观看| 男女那种视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| av福利片在线| 久久精品人妻少妇| 伦理电影免费视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 欧美日韩乱码在线| 悠悠久久av| www.精华液| 久久99热这里只有精品18| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品91蜜桃| 给我免费播放毛片高清在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 97碰自拍视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天堂动漫精品| 757午夜福利合集在线观看| 我要搜黄色片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产高清videossex| 香蕉丝袜av| 在线a可以看的网站| 欧美乱妇无乱码| avwww免费| 国产成人啪精品午夜网站| 舔av片在线| 无限看片的www在线观看| 久久香蕉激情| 欧美精品亚洲一区二区| 国产亚洲欧美98| 国产精品久久久久久精品电影| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美zozozo另类| 国产精品98久久久久久宅男小说| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产99久久九九免费精品| 哪里可以看免费的av片| 一级黄色大片毛片| 老司机午夜福利在线观看视频| av在线播放免费不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜久久久久精精品| 免费电影在线观看免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 丰满的人妻完整版| 床上黄色一级片| 日本一二三区视频观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产欧美日韩一区二区三| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av电影在线进入| 777久久人妻少妇嫩草av网站| aaaaa片日本免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 又紧又爽又黄一区二区| 日韩大码丰满熟妇|