MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜在本科開放創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

姜麗艷 閆國(guó)棟 劉文婧 孫碩 高貴

摘? 要 介紹利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀建立一種快速分析水溫對(duì)嬰幼兒配方奶粉蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)，考察水溫對(duì)嬰幼兒配方奶粉蛋白質(zhì)的影響，旨在本科開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引入大型儀器設(shè)備基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，使學(xué)生認(rèn)識(shí)水溫對(duì)嬰幼兒配方奶粉蛋白質(zhì)影響的同時(shí)，更熟練地掌握基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)原理和操作技術(shù)，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力和綜合素質(zhì)。

關(guān)鍵詞 大型儀器設(shè)備;質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜;開放創(chuàng)新實(shí)驗(yàn);奶粉;水溫

中圖分類號(hào)：G642.423? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-489X（2019）04-0116-03

Abstract The technique of quickly analyzing the influence of pro-teins in infant formula milk powder diluted with water at different temperatures by MALDI-TOF/TOF MS， is established， and the effect of water temperatures on proteins in infant formula milk powderis studied. Through the open innovation experiment for undergra-duates by MALDI-TOF/TOF MS， students can get a deeper under-standing on the effect of water temperatures on proteins in infantformula milk powder. Meanwhile， students can master the experi-mental principles and techniques of MALDI-TOF/TOF MS. The stu-dents scientific research ability and comprehensive quality are trained.

Key words large-scale instrument and equipment; MALDI-TOF/TOF?MS; open innovation experiment; milk powder; water temperature

1 引言

大型儀器設(shè)備是高校的優(yōu)質(zhì)資源，是培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要硬件基礎(chǔ)[1-2]。但因大型儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，維修成本高，操作煩瑣及臺(tái)件數(shù)少等瓶頸問題，致使目前本科實(shí)踐教學(xué)中大型儀器設(shè)備的使用效益并不高[2-3]。為了充分發(fā)揮大型儀器設(shè)備在學(xué)生實(shí)踐能力、思維創(chuàng)新能力和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)能力培養(yǎng)中的作用，必須克服困難，充分挖掘大型儀器設(shè)備在教學(xué)中的各種功能，使大型儀器設(shè)備能夠更好地為高素質(zhì)人才培養(yǎng)服務(wù)，為本科學(xué)生的教學(xué)實(shí)踐服務(wù)[4-5]。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）用于多肽、蛋白質(zhì)組學(xué)、核酸、糖類、藥物和有機(jī)化合物等領(lǐng)域的研究，主要應(yīng)用于生物大分子的定性和組織成像等方面的科研工作[6-8]。MALDI-TOF/TOF MS具有的靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正發(fā)揮越來越重要的作用[9-10]。奶粉中的蛋白質(zhì)多數(shù)為酪氨酸、乳清蛋白、乳球蛋白等大分子質(zhì)量的蛋白，因此，用MALDI-TOF/TOF MS進(jìn)行蛋白組分析及性質(zhì)考察是一個(gè)很好的表征手段[11]。

2 實(shí)驗(yàn)原理

MALDI-TOF/TOF是一種軟電離技術(shù)，不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子。它可直接應(yīng)用于混合物的分析，也可用來檢測(cè)樣品中是否含有雜質(zhì)及雜質(zhì)的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白質(zhì)等鑒定中首要的參數(shù)[12]。MALDI-TOF/

TOF的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%～0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，目前可測(cè)定生物大分子的分子量高達(dá)600 kDa?；驹硎菍悠贩稚⒃诨|(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)—樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即通過離子的質(zhì)量電荷之比（m/z）與離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量[13]（圖1）。

3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1）利用基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)建立一種快速分析水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)影響的技術(shù)方法;2）系統(tǒng)考察水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)的影響;3）熟練掌握基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)方法及原理。

4 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

實(shí)驗(yàn)設(shè)備? 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（AB公司5800）。

實(shí)驗(yàn)材料及試劑? 市售嬰幼兒配方奶粉（美素力金裝1段、金領(lǐng)冠2段、合生元金裝1段等）;α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，芥子酸（SA基質(zhì)）（美國(guó)Sigma公司）;乙腈（色譜純）;Milli-Q去離子水;三氟乙酸（TFA）。

5 實(shí)驗(yàn)方法

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備? 取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加入1 ml室溫去離子水，配制為20 mg/ml濃度，充分渦旋后靜置

5 min，使用時(shí)取上清液。

奶粉樣品制備? 平行稱取合生元、美素佳兒、金領(lǐng)冠三份奶粉樣品（1～3號(hào)）于5 ml離心管中，每份20 mg;分別加入1 ml室溫、40 ℃、100 ℃水沖調(diào)制樣，充分混勻后自然冷卻;13 000 r，離心10 min，取中間清液于干凈ep管中，待質(zhì)譜鑒定。

配制SA基質(zhì)溶液? 用乙腈—水—0.1% TFA（4：5：1，V/V）溶解制成飽和溶液1 ml，充分渦旋后靜置5 min，使用時(shí)取上清液。

點(diǎn)樣? 實(shí)驗(yàn)采用通常使用的混合點(diǎn)樣法，即將基質(zhì)與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與基質(zhì)按1：1（V/V）比例混合后直接點(diǎn)在靶板上，自然干燥，以能夠在靶板上形成淡黃色雪花狀結(jié)晶薄層為宜。

質(zhì)譜條件的選擇? 由于本實(shí)驗(yàn)考察的是蛋白質(zhì)大分子受水溫的影響情況，不需酶解處理，因此采用正離子線性模式進(jìn)行MALDI-TOF/TOF MS的測(cè)定。設(shè)定分子量檢測(cè)范圍為5000～100 000 Da。激光在樣品點(diǎn)上隨機(jī)打擊50個(gè)位置，每個(gè)位置上的激光打擊次數(shù)為20。激光能量為5500～6000微焦。

數(shù)據(jù)對(duì)比匹配? 牛奶中的乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。根據(jù)樣品質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)SDS進(jìn)行對(duì)比，研究不同的水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)的影響。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

嬰幼兒配方奶粉中主要蛋白種類和分子量測(cè)定? 實(shí)驗(yàn)首先采用SDS-PAGE法分別測(cè)定市售的七種嬰幼兒配方奶粉中蛋白質(zhì)的種類和分子量，以便為后續(xù)的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)選定分子量的檢測(cè)范圍和蛋白質(zhì)分子量比對(duì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)市售的完達(dá)山、雀巢、金領(lǐng)冠、惠氏、美素佳兒、合生元和喜寶這七種嬰幼兒配方奶粉中，大多含有酪蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白和乳球蛋白等，如圖2所示。其中，κ-casein酪蛋白的分子量為19 000 Da，α-casein酪蛋白的分子量為23 600 Da，β-casein酪蛋白的分子量為24 000 Da，脂肪酸結(jié)合蛋白的分子量14 000～15 000 Da。

水溫對(duì)嬰幼兒配方奶粉蛋白質(zhì)的影響? 利用MALDI-TOF/TOF MS研究水溫對(duì)金領(lǐng)冠、合生元和美素佳兒嬰幼兒配方奶粉蛋白質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3～圖5。

由圖3可見，不同溫度的水對(duì)金領(lǐng)冠奶粉的蛋白質(zhì)影響顯著。用常溫水時(shí)，金領(lǐng)冠奶粉中脂肪酸結(jié)合蛋白和β-casein酪蛋白的相對(duì)含量較高;而用40 ℃水沖泡時(shí)，β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白的相對(duì)含量顯著增多，脂肪酸結(jié)合蛋白基本檢測(cè)不到;100 ℃水時(shí)，主要的還是β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白，但相對(duì)含量都顯著減少。

圖4分析了不同水溫對(duì)合生元奶粉蛋白質(zhì)的影響。通過分析可以看出，用不同的水溫沖泡合生元奶粉時(shí)，檢測(cè)的大多為β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白，只是40 ℃水時(shí)，β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白的相對(duì)含量最高。

通過圖5可見，水溫對(duì)美素佳兒奶粉蛋白質(zhì)的影響不顯著，常溫水和40 ℃水時(shí)，多為β-casein酪蛋白和乳凝集素蛋白;100 ℃水時(shí)，檢測(cè)有脂肪酸結(jié)合蛋白。

可見，不同的水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)的影響不同，但其影響沒有特定的規(guī)律，根據(jù)奶粉的種類不同而具有差異。

7 結(jié)語(yǔ)

為了有效開闊學(xué)生的專業(yè)視野，提高大型儀器設(shè)備的共享效率，將大型貴重儀器MALDI-TOF/TOF MS引入本科學(xué)生的開放創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中，開設(shè)利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜快速分析水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)影響的開放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生自行查閱文獻(xiàn)，撰寫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì);按照設(shè)計(jì)內(nèi)容，學(xué)生完成樣品的準(zhǔn)備和制備過程，樣品測(cè)試分析在實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的引領(lǐng)下完成;在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生不僅了解水溫對(duì)奶粉蛋白質(zhì)的影響，而且有效地掌握MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜的相關(guān)測(cè)試手段，提高了科研能力，培養(yǎng)了創(chuàng)新思維。同時(shí)，有效完成了大型儀器設(shè)備向本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的延伸，進(jìn)一步提高了大型儀器設(shè)備的優(yōu)質(zhì)資源共享效率。

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