LC-MS/MS法測(cè)定毛曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿的含量

陳 靜 ，張 鳳 ，張 銳 ，李 卿 ，范惠珍

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西，宜春 336000； 2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科，上海 20003）

曼陀羅亦稱“風(fēng)茄兒”，為茄科曼陀羅屬，一年生草本植物。它是一種歷史悠久的藥用植物，分布廣泛，可用于治療關(guān)節(jié)痛、哮喘、咳嗽、胃腸痙攣、神經(jīng)性偏頭痛、止痛、痛風(fēng)、燙傷、潰瘍、狂躁、癲癇癥、抑郁癥、風(fēng)濕癥、抽搐、跌打損傷等癥。生物堿莨菪烷類是曼陀羅中的主要化學(xué)成分。也是其主要的毒性以及活性成分[1]，并且活性比較高。其中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿等生物堿具有解痙陣痛、止咳平喘、麻醉鎮(zhèn)靜的功效[2]，并可用于緩解內(nèi)臟絞痛[3]，但對(duì)人有劇毒，中毒多見(jiàn)于兒童誤食曼陀羅、莨菪等植物的花果所致[4]。曼陀羅中毒的主要表現(xiàn)有口渴舌燥、發(fā)音嘶啞、顏面潮紅、頭暈惡心、嘔吐、煩躁不安、語(yǔ)無(wú)倫次、瞳孔散大、視物模糊、抽搐痙攣等[5]癥狀。

曼陀羅具有多種生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)林業(yè)中。隨著對(duì)其藥理作用的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其諸多的藥用價(jià)值，讓莨菪堿更廣泛地在臨床上與醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，也讓其需求量迅速地增長(zhǎng)[2]。已經(jīng)有研究利用曼陀羅毛狀根部生產(chǎn)生物堿的報(bào)道[6]，曼陀羅成分復(fù)雜繁多，使用傳統(tǒng)的方法 TLC、HPLC、GC-MS等把莨菪堿類完全分離是非常困難的。本研究建立LC-MS/MS方法對(duì)曼陀羅中的莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿的含量進(jìn)行測(cè)定，研究結(jié)果顯示，該方法簡(jiǎn)便，靈敏度、重復(fù)性好，用時(shí)較短，可用于其含量的測(cè)定，值得進(jìn)一步推廣。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

安捷倫1200液相色譜-G6410A三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，美國(guó)），包含G1311A輸液泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，DAD檢測(cè)器，G1314BVWD檢測(cè)器，MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理工作站（Agilent，美國(guó)）；labnet定時(shí)可調(diào)速旋渦混合器（labnet，美國(guó)）；超聲儀（SK7200H型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Eppendorf移液器（100、200、1000 μL，德國(guó)）；容量瓶。

1.2 藥材及試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿、華法林（上海銳生物科技有限公司）純度98%）。

待測(cè)物：曼陀羅的毛狀根部（12個(gè)不同批次）（上海長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科李卿副教授提供），甲醇（Merck，德國(guó)）、甲酸（Merck，德國(guó)）、乙腈（Merck，德國(guó)）、水（屈臣氏）、鹽酸（上海裕納有限公司）、濃氨水（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子；毛細(xì)管電壓：4000 V；截取錐電壓：60 V；氣體溫度 ：350 ℃；氣體流速：10 L/min。待測(cè)物以及內(nèi)標(biāo)華法林的MRM模式參數(shù)如表1。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 The conditions of mass spectrometry

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm），流動(dòng)相：乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；單針時(shí)間：3 min

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取50 mg用蒸餾水沖洗干凈并且用濾紙吸去多余水分，50℃烘至恒重的毛狀根樣品，研磨成干粉；加入10 mL鹽酸，超聲30 min，冷卻、過(guò)濾，再用10 mL鹽酸分三次洗滌濾渣；與上述過(guò)濾液合并，用濃氨水調(diào)節(jié)pH=9，超聲45 min；再加6 mL三氯甲烷，充分振蕩；冷凍干燥（20 ℃，2000 rmp）殘留物溶于2 mL三氯甲烷中（有黃色不容物，超聲3 min）12000 rpm離心5 min，吸取上清液20 μL用甲醇稀釋10倍，備用。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制

分別精密稱取莨菪堿 0.9 mg、東莨菪堿0.64 mg、山莨菪堿0.88 mg，用甲醇定容至2 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，備用。

2.4.2 線性溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)品莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿母液用甲醇稀釋成濃度分別1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000的混標(biāo)溶液，備用。

2.4.3 內(nèi)標(biāo)的配制

精密取適量標(biāo)準(zhǔn)品華法林用甲醇溶解配制成10 ng/mL，備用。

2.5 線性關(guān)系的建立

按照上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，對(duì) 2.4.2下的濃度梯度進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的線性回歸方程分別是 Y=813.8904X+2165.3000（R2=0.9922）、Y=714.1221X+517.4311（R2=0.9892）、Y=872.9971X+1024.4247（R2=0.9952），分別在 1～200、1～1000、1～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 專屬性的實(shí)驗(yàn)

取適量供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液各1份，按上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。在同一檢測(cè)條件下，陰性對(duì)照無(wú)明顯干擾，對(duì)照品與供試品在相同的出峰時(shí)間分別出現(xiàn)了莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿色譜峰，出峰時(shí)間均在1 min左右，用時(shí)比較短，分離度高。各成分的色譜圖如圖1、圖2、圖3：

圖1 樣本的色譜圖Fig.1 Chromatogram map of the sample

圖2 混標(biāo)的色譜圖Fig.2 Chromatogram map of the scopolamine

圖3 為陰性對(duì)照色譜圖Fig.3 Chromatogram map of blank

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份相同量的供試品，分別加入相同量的對(duì)照品，按上述2.3的方法制備供試品，按照2.1與2.2的測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄各待測(cè)成分的峰面積。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，6份供試品中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的平均加樣回收率分別為：97.17%；97.20%；92.68%；RSD 分別為 1.02%、1.31%、1.41%。RSD≤2，說(shuō)明樣本的處理過(guò)程影響小，測(cè)定方法的準(zhǔn)確度高，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三種成分加樣回收率的測(cè)定結(jié)果Table 2 The results 0f 3 samples recovery test

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同一環(huán)境下，同一個(gè)操作人員，取6份供試品，分別加入相同量的對(duì)照品，按上述 2.1.1的方法制備供試品，在上述2.2與2.3的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄各待測(cè)成分的峰面積。一份供試品連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄供試品莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的峰面積。RSD分別為1.38%、1.31%、1.21%。說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性比較好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

相同條件下，同一個(gè)操作人員，取同一份供試品，按上述2.1.1方法制備供試品溶液，在上述2.2與2.3的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果表明供試品中的3種成分性質(zhì)在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，RSD≤2，說(shuō)明該方法對(duì)24 h內(nèi)的供試品測(cè)定是穩(wěn)定的，結(jié)果如表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（ng/mL）Table 3 The results of stability experiments

2.10 樣本測(cè)定的結(jié)果

采用上述建立的 LC-MS含量測(cè)定方法，測(cè)定12份不用批次的供試品毛曼陀羅中三種成份的含量，按照上述2.3方法進(jìn)行處理，在上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，每份供試品重復(fù)進(jìn)樣3次，其平均值作為曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 曼陀羅中3種成分的濃度分別為（ng/mL）Table 4 The contents of various compounds in 3 mandola

3 討論

曼陀羅中莨菪堿含量的測(cè)定方法目前有酸堿滴定法[8]、反相離子對(duì)液相色譜法(GC-MS)[9]、高效相色譜法(HPLC)[10]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[11]等。近年來(lái)，醫(yī)療行業(yè)主要采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定曼陀中莨菪堿的含量，但是此方法的靈敏度比較差[7]，對(duì)流動(dòng)相的要求比較繁瑣[12]。本研究建立 LC-MS/MS方法用于測(cè)定曼陀羅毛根部莨菪堿的含量，該方法不僅靈敏度好，流動(dòng)相僅是采用等度的乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32，出峰時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)用時(shí)較少，操作簡(jiǎn)單，并且靈敏度高。

莨菪堿類為典型的生物堿類，按傳統(tǒng)的生物堿的提取方法，色譜圖出現(xiàn)雜峰較多且分離度不好。本實(shí)驗(yàn)采用了酸提取，提取回收率比較高，由于酸提取后過(guò)濾困難，因此本實(shí)驗(yàn)又分別試了甲醇和三氯甲烷，再進(jìn)行提取過(guò)濾，結(jié)果三氯甲烷提取回收率高于甲醇，故選擇三氯甲烷作為再提取過(guò)濾的溶媒。本試驗(yàn)采用鹽酸、濃氨水、三氯甲烷的萃取方法進(jìn)行提取，不僅提取回收率高，色譜圖也比較簡(jiǎn)單，該方法適合用于曼陀羅中生物堿的提取與分離。

本實(shí)驗(yàn)采用的是色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)，對(duì)酸性、堿性化合物都表現(xiàn)出很好的分離性能，且分離度比較高。采用此色譜柱不僅出峰時(shí)間比較早且峰型好，沒(méi)有出現(xiàn)拖尾及裂峰等現(xiàn)象。由于上述樣本處理中采用了甲醇對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，為了避免溶劑效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)標(biāo)均采用甲醇進(jìn)行溶解。

本研究建立的LC-MS/MS的方法能夠很好的將曼陀羅中的莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿提取與分離，此方法操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好，回收率高，可以用于曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿含量的測(cè)定。