水環(huán)境中甲狀腺激素干擾物分析方法研究進(jìn)展

周 秀 花,2，趙 高 峰2，趙 曉 輝2，張 盼 偉2，李 昆2，熊 楠，金 士 威

(1.中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074； 2.中國(guó)水利水電科學(xué)研究院，北京 100038)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的日益提高，各種化工產(chǎn)品、醫(yī)藥產(chǎn)品、農(nóng)業(yè)化肥、除草劑以及殺蟲(chóng)劑等有機(jī)化學(xué)產(chǎn)品通過(guò)工業(yè)廢水和生活污水的直接排放以及農(nóng)用化學(xué)品的土壤滲漏、地表徑流和大氣沉降進(jìn)入到水體中，使得大量的有機(jī)污染物進(jìn)入水環(huán)境，給水體的生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅[1]。內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disruptors, EDs)是一類(lèi)廣泛存在于生活污水、河流、湖泊及海洋等水環(huán)境中的污染物。20世紀(jì)90年代以來(lái)的研究表明，在長(zhǎng)期、低劑量暴露下，EDs能夠干擾人類(lèi)和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖功能下降、生長(zhǎng)發(fā)育異常和免疫力降低等一系列癥狀，甚至有致癌、致畸、致突變的“三致”作用，對(duì)生態(tài)環(huán)境和生物體的健康產(chǎn)生危害[2]。EDs在水環(huán)境中的污染特征研究已是當(dāng)前學(xué)術(shù)界和公眾共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

根據(jù)內(nèi)分泌干擾機(jī)制，EDs可分為雌激素類(lèi)干擾物、雄激素類(lèi)干擾物、甲狀腺激素類(lèi)干擾物、腎上腺素類(lèi)干擾物、胰島素類(lèi)干擾物、孕激素類(lèi)干擾物、糖皮質(zhì)激素類(lèi)干擾物等。其中，對(duì)甲狀腺激素的干擾效應(yīng)的研究，是近年來(lái)學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。

甲狀腺是脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的內(nèi)分泌腺，其分泌的甲狀腺激素(Thyroid Hormone，TH)在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、組織分化、能量代謝和維護(hù)大腦功能等方面發(fā)揮著非常重要的作用，是人類(lèi)和動(dòng)物生理過(guò)程中不可或缺的重要激素[3]。研究證實(shí)多種環(huán)境污染物，包括酚類(lèi)化合物、溴代阻燃劑、農(nóng)藥等可影響甲狀腺的正常功能，如抑制TH的合成和分泌、抑制甲狀腺對(duì)碘的吸收等[4]。這類(lèi)對(duì)TH有干擾效應(yīng)的化合物被稱(chēng)為甲狀腺激素干擾物(Thyroid Hormone Disruptors，THDs)。THDs已成為繼環(huán)境雌激素之后最重要的一種EDs。研究顯示，多種THDs可以通過(guò)與TH或TH受體結(jié)合模擬TH作用來(lái)影響甲狀腺激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等環(huán)節(jié)，形成多種作用機(jī)制來(lái)干擾甲狀腺功能。例如雙酚A(BPA)[5]、多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)[6]通過(guò)干擾甲狀腺激素(TH)的信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)，導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)多種THDs的暴露能引起甲狀腺濾泡細(xì)胞肥大、厚度增大、膠質(zhì)減少、血管增生和充血等現(xiàn)象[7]，如Lee S.H.等[8]研究表明2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英(TCDD)能導(dǎo)致大鼠甲狀腺組織充血和腫脹，濾泡體積顯著減小；Zhang Z.F等[9]關(guān)于2,2′,4,4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)可引起小鼠肝臟甲狀腺激素受體TRα1、TRβ1mRNA蛋白的表達(dá)，表明了THDs對(duì)甲調(diào)基因及TH代謝關(guān)鍵酶也產(chǎn)生影響。

鑒于水環(huán)境中的THDs種類(lèi)繁多、分布廣泛，已經(jīng)對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康存在潛在的威脅，開(kāi)發(fā)建立水環(huán)境中的快速、可靠、靈敏、準(zhǔn)確THDs的檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。本文綜述了目前水環(huán)境中THDs的主要分析方法—化學(xué)分析法和生物測(cè)試法，以期更好地開(kāi)展對(duì)水環(huán)境中THDs的污染特征及生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)。

1 甲狀腺激素干擾物的化學(xué)分析方法

甲狀腺激素干擾物在水環(huán)境中濃度極低，且水體中復(fù)雜基質(zhì)干擾較大，在分析前一般要經(jīng)過(guò)樣品前處理過(guò)程，以富集痕量組分、消除基體干擾、提高方法靈敏度以及去除對(duì)儀器或分析系統(tǒng)有影響的物質(zhì)[10]?；瘜W(xué)分析方法主要分為樣品前處理技術(shù)和儀器分析方法。而前處理技術(shù)是儀器分析前的必要步驟。因此，樣品前處理在化學(xué)分析中起著重要作用，它是水環(huán)境中THDs分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

1.1 樣品前處理技術(shù)

在環(huán)境水樣分析中，采集的樣品具有復(fù)雜性、多樣性以及痕量性等特點(diǎn)，因此樣品在進(jìn)行儀器分析檢測(cè)之前，一般需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以去除具有干擾作用的非目標(biāo)化合物[11]。樣品前處理包括提取、凈化、濃縮等步驟。對(duì)于水環(huán)境中THDs檢測(cè)，常見(jiàn)的前處理技術(shù)包括：采用索氏萃取(Soxhlet extraction, SE)對(duì)水環(huán)境中固體或半固體的樣品進(jìn)行目標(biāo)化合物的提取，通過(guò)液液萃取(Liquid-liquid extraction, LLE)對(duì)水環(huán)境中的水體進(jìn)行目標(biāo)化合物的提取。作為最傳統(tǒng)的萃取方法，它們具有萃取效果好、設(shè)備裝置簡(jiǎn)單、成本低、可同時(shí)萃取多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)，但也存在萃取劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)、分析人員勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)。此外，超聲波萃取(UE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、微波輔助萃取(MAE)、分散液液萃取(DLLME)、超臨界流體萃取(SFE)、單液滴微萃取(SDME)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)、分子印跡固相萃取(MISPE)等都是近年來(lái)普遍使用的萃取技術(shù)。表1對(duì)這些萃取方法進(jìn)行了比較。

1.2 儀器分析方法

1.2.1氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)

GC是THDs最常用的測(cè)定方法(見(jiàn)表2)。為了提高分析技術(shù)的全面適應(yīng)性，常常將具有高選擇性、高靈敏度以及高分辨率的質(zhì)譜與許多分離過(guò)程相聯(lián)接。對(duì)于THDs的定性定量研究，應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的方法是GC/MS，GC/MS由于具有良好的分離效率以及高分辨率被用于測(cè)定環(huán)境水體中的THDs。目前，已建立一個(gè)包含十幾萬(wàn)種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜庫(kù)，例如美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院建立的NIST譜庫(kù)[21]，能夠快捷查出物質(zhì)及其性質(zhì)。近年來(lái)，GC/MS法因其高靈敏度、高通用性和高選擇性而成為檢測(cè)痕量THDs的重要手段，且經(jīng)選擇離子檢測(cè)(SIM)可以達(dá)到更高的靈敏度，同時(shí)能夠準(zhǔn)確證明化合物的結(jié)構(gòu)。但是GC/MS并不適用于一些熱不穩(wěn)定性、需要衍生化再進(jìn)行檢測(cè)的THDs。

表1 樣品前處理萃取技術(shù)的比較Tab.1 Comparison of extraction techniques in sample pretreatment

1.2.2液相色譜(LC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)

雖然GC和GC/MS是水環(huán)境中THDs檢測(cè)的一種重要的方法，但是隨著THDs種類(lèi)的增加，對(duì)儀器條件要求越來(lái)越高。而LC能有效分離熱不穩(wěn)性高沸點(diǎn)化合物的分離與MS很強(qiáng)的組分鑒定相結(jié)合形成了LC/MS技術(shù)。LC/MS是一種分離分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段，可以對(duì)THDs進(jìn)行可靠和明確的量化[22]。對(duì)于那些相對(duì)分子量大、高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差的THDs(如酚類(lèi)化合物、固醇類(lèi)等化合物)，LC和LC/MS方法顯示出其優(yōu)勢(shì)，有助于全面把握各種THDs的污染現(xiàn)狀。M Khaksari等[23]應(yīng)用LC/MS檢測(cè)廢水中THDs，檢出限可達(dá)到ppt級(jí)水平。

伴隨著超高效液相(UPLC)及其超高效液相質(zhì)譜(UPLC/MS)甚至是超高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)(UPLC-MS/MS)的出現(xiàn)，THDs的分析和檢測(cè)效率大大提高，試劑消耗大幅下降。UPLC-MS/MS是一種準(zhǔn)確度高、精密度高、樣品處理簡(jiǎn)單、無(wú)雜質(zhì)干擾、分離范圍廣的快速分離方法，它對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)破壞性小，適合THDs的分離。

2 甲狀腺激素干擾物的生物測(cè)試方法

化學(xué)分析定性準(zhǔn)確，但設(shè)備要求高，費(fèi)用昂貴，而且不能直接檢測(cè)出水環(huán)境甲狀腺激素的生物干擾效應(yīng)，而生物測(cè)試方法可通過(guò)研究水環(huán)境中水體作用下生物體內(nèi)基因表達(dá)的上調(diào)或下抑、蛋白合成的改變、細(xì)胞的增殖以及組織的病變等各種指標(biāo)的變化，直接表征甲狀腺激素可能給生物體帶來(lái)的影響。因此，在環(huán)境THDs研究領(lǐng)域內(nèi)，生物檢測(cè)法成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。生物測(cè)試法一般按照測(cè)試對(duì)象不同可以分為活體檢測(cè)和離體檢測(cè)。

表2 水環(huán)境中甲狀腺激素干擾物化學(xué)分析方法Tab.2 Chemical analysis of THDs in water environment

2.1 活體檢測(cè)法

活體檢測(cè)法[40]主要通過(guò)檢測(cè)水體中暴露于生物體內(nèi)甲狀腺激素水平、觀察甲狀腺組織改變等表征甲狀腺激素的生物干擾效應(yīng)?；铙w檢測(cè)對(duì)象包括魚(yú)類(lèi)、哺乳類(lèi)、兩棲類(lèi)動(dòng)物和蛙類(lèi)等。其中，魚(yú)類(lèi)為常用的研究對(duì)象，主要包括斑馬魚(yú)(Danio rerio)、虹鱒魚(yú)(Rainbow trout)、黑頭木魚(yú)(Pimephales promelas)等(見(jiàn)表3)。孫丁等[41]在葉枯寧對(duì)大鼠血清FT4和TSH水平的影響及其時(shí)效關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，該農(nóng)藥對(duì)大鼠血清FT4和TSH水平的影響發(fā)生在5 d之內(nèi)，并可繼發(fā)引起甲狀腺増生。通過(guò)觀察活體THDs形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、生殖和特定生化指標(biāo)的變化可以有效地對(duì)THDs進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。

2.2 離體檢測(cè)法

活體檢測(cè)能快速、靈敏地確定外源化合物的內(nèi)分泌干擾作用[52]，相比于活體檢測(cè)法，離體檢測(cè)是一種快速而又經(jīng)濟(jì)有效的方法，由于該方法的特異性，它能達(dá)到更低的檢測(cè)限[53]，能夠直接測(cè)定環(huán)境樣品的內(nèi)分泌干擾活性。離體檢測(cè)法主要有分子檢測(cè)法、組織檢測(cè)法、細(xì)胞檢測(cè)法等。其中，分子檢測(cè)法和組織檢測(cè)法常用于甲狀腺疾病等醫(yī)學(xué)研究，而細(xì)胞檢測(cè)法在水環(huán)境甲狀腺激素干擾效應(yīng)中應(yīng)用最廣、發(fā)展最快。

表3 水環(huán)境中甲狀腺激素干擾物的活體檢測(cè)Tab.3 In vivo detection of THDs in water environment

2.2.1分子檢測(cè)法

甲狀腺疾病是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，也是人群中常見(jiàn)的疾病[54]。甲狀腺疾病的診斷十分重要，對(duì)臨床醫(yī)師的診斷方案起到關(guān)鍵性作用[55]。在醫(yī)學(xué)方面，細(xì)胞檢測(cè)存在不明確的非典型病變?cè)\斷。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，分子基因檢測(cè)能夠明顯提高細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果[56]。Cantara S等研究表明細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)與分子檢測(cè)結(jié)合能夠提高甲狀腺疾病的診斷效果[57]。

2.2.2組織檢測(cè)法

生物組織具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，且局部TH作用具有組織特異性?xún)?yōu)化[58]。組織檢測(cè)是以組織特異性方式評(píng)估TH濃度，其具有可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、損傷小等優(yōu)點(diǎn)[59]。Liu QJ等[60]研究表明多態(tài)性上皮黏蛋白(PEM)在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及其分布特點(diǎn)可作為甲狀腺癌的鑒別診斷指標(biāo)。

2.2.3細(xì)胞檢測(cè)法

水環(huán)境中細(xì)胞檢測(cè)法所用的細(xì)胞須富含TR，同時(shí)具有甲狀腺激素依賴(lài)性增殖的特點(diǎn)[61]。細(xì)胞檢測(cè)法主要采用的細(xì)胞系包括大鼠垂體瘤細(xì)胞GH3、甲狀腺細(xì)胞系中的FRTL-5、PCC13、Th1以及受體報(bào)告基因等，細(xì)胞經(jīng)過(guò)改造后再對(duì)THDs進(jìn)行檢測(cè)的方法稱(chēng)為受體報(bào)告基因檢測(cè)。常見(jiàn)的甲狀腺激素干擾物的細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)用如表4所示。

表4 水環(huán)境中甲狀腺激素干擾物的細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)用Tab.4 In vitro detection of THDs in water environment

2.2.4重組基因雙雜交酵母檢測(cè)法

重組基因雙雜交酵母檢測(cè)法的主要原理為：水環(huán)境中的THDs進(jìn)入酵母細(xì)胞，然后通過(guò)與甲狀腺激素受體和受體共激活因子蛋白結(jié)合，啟動(dòng)報(bào)告基因LacZ的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶的活性可用于表征化合物對(duì)TR的干擾活性。李劍等已成功構(gòu)建了重組人甲狀腺激素受體(hTR)和與hTR對(duì)應(yīng)的共激活因子基因的雙雜交酵母體系，還對(duì)一系列環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了篩選[62]。但是，當(dāng)外源化合物進(jìn)入人體后，體內(nèi)的代謝酶會(huì)對(duì)外源化合物進(jìn)行芳烴化、磺化、甲基化、羥基化等作用，這些作用能促使一些化合物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)造成生物滅活或是生物活化[63]。重組基因雙雜交酵母檢測(cè)法是通過(guò)構(gòu)建重組TR基因酵母，用來(lái)檢測(cè)水環(huán)境水樣中甲狀腺激素干擾活性[64]。通過(guò)對(duì)北京地區(qū)不同水體THDs的活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高碑店污水處理廠的AH當(dāng)量為16.12～424.51 μg/L[65]、官?gòu)d水庫(kù)的AH當(dāng)量為21.00～2147.20 μg/L[66]以及北京市飲用水源地的NH3當(dāng)量為180.80～280.20 μg/L[67]，表明這些水體均有檢測(cè)出TR抑制活性，但尚未檢測(cè)出TR誘導(dǎo)活性。重組基因雙雜交酵母檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，因此在水環(huán)境的THDs檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

3 展 望

鑒于水環(huán)境中的THDs對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物存在健康風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)展水環(huán)境中THDs的篩查與毒理學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。雖然目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)水環(huán)境中THDs的分析開(kāi)展了大量的研究，但是尚不深入，而且進(jìn)入水環(huán)境中的THDs越來(lái)越多，今后應(yīng)該從以下幾個(gè)方面開(kāi)展更深入的研究工作：① 目前，對(duì)水環(huán)境中的THDs的分析主要以復(fù)雜、昂貴的儀器分析方法為主，前處理過(guò)程復(fù)雜，對(duì)多種THDs的富集效果差，有必要開(kāi)發(fā)富集能力強(qiáng)、選擇性好的前處理方法，以實(shí)現(xiàn)靈敏，經(jīng)濟(jì)、高通量的分析；② 應(yīng)開(kāi)發(fā)快速、靈敏、高效的生物檢測(cè)法，尤其是利用轉(zhuǎn)基因等技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效、高通量的離體檢測(cè)；③ 水環(huán)境中的THDs濃度低，需要開(kāi)發(fā)長(zhǎng)期低劑量暴露的活體生物評(píng)價(jià)方法，以全面、正確評(píng)估THDs的健康風(fēng)險(xiǎn)。