海產(chǎn)品中4種副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的研究

楊平　黃靜敏　陳晶　劉小青　蘭全學(xué)

摘要 分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)MPN法、紙片法改良MPN法（R-MPN）和疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF）對(duì)50個(gè)海水及牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，R-MPN法和HGMF法的檢出量比另外2種方法高，差異顯著（P<0.05）。紙片法的特異性最高，其次是HGMF法，R-MPN法和MPN法的特異性相對(duì)較低：本文通過(guò)比較4種副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的檢出量和特異性，以期為今后的檢測(cè)方法改進(jìn)提供參考。

關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌;MPN法;紙片法;改良MPN法;疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF）

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）08-0238-02

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見(jiàn)的食源性致病菌"。尤其在沿海地區(qū)，自1998年來(lái)副溶血性弧菌引起細(xì)菌性食物中毒危害已取代沙門(mén)氏菌12。由于副溶血性弧菌廣泛存在于海水以及魚(yú)、蝦、蟹、貝類(lèi)和海藻等海產(chǎn)品中，近年來(lái)隨著保鮮和物流業(yè)的迅速發(fā)展，海產(chǎn)品得以運(yùn)輸?shù)絻?nèi)陸銷(xiāo)售，而副溶血性弧菌污染地區(qū)范圍正隨著海產(chǎn)品消費(fèi)范圍的擴(kuò)大而擴(kuò)大B。副溶血性弧菌對(duì)環(huán)境條件很敏感，海產(chǎn)品從沿海運(yùn)輸?shù)絻?nèi)陸一般都是采取冷凍保鮮等方式，在此過(guò)程中副溶血性弧菌易發(fā)生亞致死損傷4。但只要環(huán)境適宜，損傷的副溶血性弧菌會(huì)發(fā)生復(fù)蘇，這對(duì)水產(chǎn)品的食品安全造成了潛在的危害。人們?cè)谑秤帽桓比苎曰【廴镜乃a(chǎn)品后，極易引起急性腸胃炎。少數(shù)嚴(yán)重病人會(huì)產(chǎn)生休克、昏迷而死亡。污染范圍及保藏運(yùn)輸條件等變化無(wú)疑對(duì)海產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)控形成新的挑戰(zhàn)。檢測(cè)手段也應(yīng)對(duì)新變化做出適當(dāng)調(diào)整，結(jié)合檢驗(yàn)方法的特點(diǎn)綜合運(yùn)用。

目前，我國(guó)建立的副溶血性弧菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)定量檢測(cè)方法為GB4789.7-2013。MPN法是最常用的細(xì)菌定量檢測(cè)方法，但其得出的結(jié)果是樣本中活菌數(shù)量的最大或然數(shù)，屬于間接的半定量分析方法，而且操作過(guò)程繁瑣。美國(guó)FDA采用的是HGMF法，通過(guò)疏水網(wǎng)格濾膜過(guò)濾截留樣品中的細(xì)菌，再進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，得到的結(jié)果以CFU/g（mL）為單位，是一種直接定量法。自20世紀(jì)70年代發(fā)展至今，HGMF已成功應(yīng)用于各種食源性致病菌的檢測(cè)中15-7。此外，本實(shí)驗(yàn)室已建立了疏水濾膜快速定量方法8以及Ray等建立的改進(jìn)MPN法（R-MPN），但不同檢測(cè)方法利用菌的某個(gè)特性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，都有其優(yōu)缺點(diǎn)，沒(méi)有一種方法能確保100%準(zhǔn)確，只能綜合考慮樣品性質(zhì)等情況，選擇某種方法或聯(lián)合使用。因此，本文通過(guò)對(duì)4種副溶血性弧菌定量方法進(jìn)行探討研究，綜合考慮方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為更好地控制副溶血性弧菌引發(fā)的食源性疾病提供參考依據(jù)。

1試驗(yàn)材料

1.1樣品采集

50個(gè)海水以及新鮮或冰凍的牡蠣采集于深圳市的海鮮市場(chǎng)、農(nóng)批市場(chǎng)、超市等。采集300mL海水樣品置于500mL無(wú)菌廣口瓶中，牡蠣樣品采集后立即置于4C冰箱保存，24～48h內(nèi)完成測(cè)試（通常24h內(nèi)）;冷凍樣品置于-18C冰箱保存。

1.2培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基和試劑包括蛋白胨/吐溫80（PT）、蛋白胨/吐溫80/3%NaCl（PTS）、副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基（VPCM，法國(guó)科瑪嘉）、大豆酪蛋白瓊脂（TSA）、3%NaCl大豆酪蛋白瓊脂、胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAM）、3%NaCl胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAMS）、ISO-GRID疏水網(wǎng)格濾膜（NEOGEN）、副溶血性弧菌鑒定紙片。

2試驗(yàn)方法

2.14種檢驗(yàn)方法

2.1.1國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)MPN法。根據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7-2013）要求進(jìn)行。

2.1.2改良MPN法（R-MPN法）。R-MPN法是Ray等在原有MPN法的基礎(chǔ)上增加一步預(yù)富集過(guò)程，即先經(jīng)過(guò)胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）預(yù)富集2h后，接著在3%NaClTSB培養(yǎng)過(guò)夜，有利于副容血性弧菌受損細(xì)胞的修復(fù)，再通過(guò)陰離子葡萄糖鹽肉湯（GST）36C培養(yǎng)過(guò)夜，鑒定。

2.1.3紙片法。把樣品稀釋液接種副溶血性弧菌鑒定紙片，于42C條件下培養(yǎng)24h，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)計(jì)算陽(yáng)性菌落數(shù)。

2.1.4疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF法）。通過(guò)疏水網(wǎng)格濾膜過(guò)濾截留樣品中的細(xì)菌，然后把濾膜放置在TSAMS培養(yǎng)基上36C修復(fù)4～5h后，轉(zhuǎn)到副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基上36C選擇性培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)。

2.2副溶血性弧菌檢測(cè)

海水樣品：海水樣品采用上述4種方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，MPN法和R-MPN法選擇10.0、1.00.1mL3個(gè)稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品;HGMF法選擇100.0、10.0、1.0mL3個(gè)稀釋度。

牡蠣樣品：稱(chēng)取25g樣品加入225mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水內(nèi)，均質(zhì)器拍打混勻制成1：10均質(zhì)液，采取，上述4種方法對(duì)均質(zhì)液進(jìn)行定量檢測(cè)。MPN法R-MPN法選擇10.0、1.0、0.1mL3個(gè)稀釋度;HGMF法選擇1.000.10、0.01mL3個(gè)稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品。

所有試驗(yàn)樣品均做3個(gè)平行，檢測(cè)結(jié)果以幾何平均值表示。

2.3菌株鑒定

分別從4種方法的培養(yǎng)物中根據(jù)菌落形態(tài)挑取50個(gè)可疑菌落劃線純化，純培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、3%NaCl三糖鐵瓊脂試驗(yàn)和嗜鹽性試驗(yàn)。采用VITEK2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行確證鑒定。

2.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3結(jié)果與分析

海水樣品和牡蠣樣品中副溶血性弧菌的定量檢測(cè)情況如表1所示。通過(guò)對(duì)比4種檢驗(yàn)方法，可以看出，4種檢驗(yàn)方法中，R-MPN法和HGMF法對(duì)于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量較高，而且2種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HGMF法對(duì)于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量最高，其次是R-MPN法，MPN法和紙片法檢測(cè)量相對(duì)較低。從海水樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，4種檢測(cè)方法的檢出量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。而對(duì)于牡蠣樣品，R-MPN法和HGMF法的檢出量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這2種方法的檢出量都明顯高于紙片法和MPN法（P<0.05）。牡蠣樣品中副溶血性弧菌的檢出量基本比海水樣品的數(shù)量高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。

分別從4種方法中隨機(jī)挑取50個(gè)副溶血性弧菌可疑菌落，采用VITEK2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定來(lái)檢驗(yàn)這幾種方法的特異性?？梢删涞奶羧≈饕鶕?jù)菌落的形態(tài)特征，沒(méi)有采用其他生化手段作為輔助。紙片法的陽(yáng)性率為98%，HGMF法的陽(yáng)性率為85%，而采用R-MPN法和MPN法的陽(yáng)性率分別為60%和66%，采用紙片法和HGMF法的特異性明顯高于R-MPN法和MPN法（P<0.05）。

4結(jié)論與討論

比較4種副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的檢出量，R-MPN法和HGMF法中副溶血性弧菌的檢出量較另外2種方法高，可能因?yàn)檫@2種方法都對(duì)副溶血性弧菌受損細(xì)胞有一個(gè)修復(fù)的步驟，R-MPN法和HGMF法首先通過(guò)在沒(méi)有選擇性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間再進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，能有效修復(fù)冷藏或冷凍過(guò)程中被損傷的副溶血性弧菌細(xì)胞。Ray等研究經(jīng)過(guò)冷藏或冷凍處理的副溶血性弧菌受損細(xì)胞的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)在TSB培養(yǎng)2h后，接著在3%NaClTSB培養(yǎng)過(guò)夜，是一個(gè)非常有效的MPN計(jì)數(shù)法前修復(fù)處理方法。通過(guò)前期試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在TSAMS上培養(yǎng)4～5h后，能有效修復(fù)副溶血性弧菌受損細(xì)胞。此外，不同取樣量也會(huì)影響結(jié)果的檢測(cè)量。如海水樣品，HGMF法1次共檢測(cè)11.0mL樣品，而MPN法1次只檢測(cè)33.33mL樣品量。對(duì)于牡蠣樣品，因?yàn)?：10均質(zhì)液容易堵塞濾膜，所以HGMF法的樣品總分析量降為0.11g。此外，復(fù)雜的數(shù)學(xué)換算也會(huì)對(duì)檢出量有一定影響。R-MPN法和MPN法得出的結(jié)果是活菌數(shù)量，得到的值單位為MPN/g（mL），可通過(guò)公式換算成CFU/g，但跟實(shí)際菌含量有一定差別。

從4種副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的特異性結(jié)果來(lái)看，紙片法和HGMF法檢測(cè)副溶血性弧菌的特異性比MPN法及R-MPN法好。紙片法是在42C條件下培養(yǎng)的，研究表明，提高檢測(cè)溫度能有效抑制其他微生物的生長(zhǎng)。然而，紙片法的特異性雖然高，但是該方法的檢出量卻很低，容易出現(xiàn)漏檢的情況，尤其對(duì)于在運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中產(chǎn)生損傷或致死的細(xì)胞。HGMF法的特異性比紙片法稍低，但檢出量高，對(duì)損傷細(xì)胞也有很好的修復(fù)步驟，不容易出現(xiàn)漏檢的情況。R-MPN法和MPN法的方法特異性相當(dāng)。

除了考慮方法的檢出量和特異性外，方法的效率性也非常重要。紙片法無(wú)需配制培養(yǎng)基，而且操作簡(jiǎn)單，可減少生化鑒定步驟，快速簡(jiǎn)便。HGMF法可以同時(shí)過(guò)濾多個(gè)樣品，同時(shí)可以縮短富集培養(yǎng)的時(shí)間。R-MPN法和MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)包括富集、分離和鑒定等所有步驟，不論是用3管6管還是9管MPN法，每個(gè)稀釋管都要經(jīng)過(guò)以上各個(gè)步驟，需要大量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)步驟，操作過(guò)程略為繁瑣，其得出的試驗(yàn)結(jié)果是樣本中目的菌活菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)值。

綜合考慮4種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)樣品和檢測(cè)要求等，結(jié)合方法的特點(diǎn)綜合運(yùn)用。如在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，紙片法快速簡(jiǎn)便，更具優(yōu)勢(shì)。MPN法雖然繁瑣，但該方法是目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢定副溶血性弧菌的定量方法，檢測(cè)結(jié)果得到國(guó)家檢定結(jié)構(gòu)和企業(yè)等的認(rèn)可。相比于MPN法，HGMF法處理大量樣品，使受損細(xì)胞得以生長(zhǎng)并被檢出，檢出量高，特異性好，可為今后改進(jìn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法提高檢驗(yàn)效率提供一定參考。

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