高效液相色譜法測(cè)定東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺

郝 宇，孫 波*，張 宇，馬藝熒，解雙瑜，李天一

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)小分子化合物，包括組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、胍丁胺、精胺、亞精胺等，其廣泛存在于生物體及多種食品中，如酒類[1-2]、水產(chǎn)品[3-4]、肉類[5-6]、發(fā)酵食品[7-8]、乳制品[9-10]等。生物胺是生物活性細(xì)胞不可缺少組分之一，是機(jī)體中生物堿、核苷酸、蛋白質(zhì)和荷爾蒙等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[11]。適量的生物胺對(duì)人體有益，但是當(dāng)人體攝入過(guò)量的外源性生物胺時(shí)，會(huì)引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[12]。

食品中生物胺的存在有3 個(gè)必要條件，首先是具有氨基酸脫羧酶活性的微生物的存在，其次是具有合成生物胺的前體物質(zhì)——游離氨基酸的存在，最后是有適合微生物生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境條件。故在富含蛋白質(zhì)和游離氨基酸的食品或在其制作過(guò)程中有微生物參與的發(fā)酵食品中則更容易積累生物胺。發(fā)酵豆制品就是一類極易積累生物胺的食品，在醬油[13]、豆豉[14]、腐乳[15]等發(fā)酵豆制品中的生物胺含量和種類均有研究報(bào)道，但在具有地域特色的東北農(nóng)家醬中的生物胺種類和含量鮮見(jiàn)報(bào)道。東北農(nóng)家醬是我國(guó)北方特有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其以大豆為原料，依靠環(huán)境中的米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物[16]自然發(fā)酵而成。其生產(chǎn)環(huán)境開(kāi)放，微生物區(qū)系復(fù)雜，這一特點(diǎn)使得東北農(nóng)家醬中存在生物胺含量積累的可能性，故檢測(cè)東北農(nóng)家醬中生物胺的種類和含量變得尤為重要。

目前，食品中生物胺的檢測(cè)和分析方法主要包括毛細(xì)管電泳法[17]、生物傳感器法[18]、薄層色譜法[19]、氣相色譜法[20]、離子色譜法[21]和反相高效液相色譜法[22]，其中高效液相色譜法是定量分析生物胺的主要檢測(cè)方法，具有檢測(cè)靈敏度高、線性關(guān)系良好、分析定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前較理想的檢測(cè)方法。而東北農(nóng)家醬因其成分復(fù)雜，含有較多的蛋白質(zhì)和油脂，使其前處理和定量檢測(cè)受到了一定限制。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)東北農(nóng)家醬中生物胺處理?xiàng)l件：提取劑的選擇、衍生劑用量的使用和衍生物萃取劑的選擇進(jìn)行研究，從而建立一種適合測(cè)定東北農(nóng)家醬生物胺含量的高效液相色譜法，并使用建立的方法測(cè)定市售東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺，該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度和靈敏度高，可為東北農(nóng)家醬的質(zhì)量安全控制提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北農(nóng)家醬 市售。

標(biāo)準(zhǔn)品：組胺鹽酸鹽（CAS號(hào)：56-92-8，98%）、酪胺鹽酸鹽（CAS號(hào)：60-19-5，98%）、腐胺鹽酸鹽（CAS號(hào)：333-94-7，98%）、亞精胺（CAS號(hào)：124-20-9，97%）、β-苯乙胺（CAS號(hào)：64-04-0，98%） 上海士鋒生物科技有限公司；丹磺酰氯（CAS號(hào)：605-65-2，99%） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、丙酮（均為色譜純）；三氯乙酸、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配2487紫外檢測(cè)器、Empower工作站） 美國(guó)Waters公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠；ZGDCY-24孔水浴氮吹儀 上海梓桂儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004分析天平 上海衡平儀器儀表廠；SZ-1型快速混勻器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽、亞精胺、β-苯乙胺分別稱取16.91、12.89、18.67、10.31、10.20 mg，用0.1 mol/L HCl溶液配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃貯存?zhèn)溆?。分別取上述溶液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取東北農(nóng)家醬10.0 g，加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，混勻，振蕩提取30 min，6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL容量瓶中，殘?jiān)?0 mL 5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀釋至刻度，待凈化。移取上述試樣提取液5 mL于25 mL具塞試管中，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入5 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，靜置分層后棄去上層有機(jī)相，下層試樣溶液加入5 mL正己烷再除脂一次，過(guò)濾，待衍生。

1.3.3 樣品衍生化

在1.3.2節(jié)待衍生的試樣溶液中依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、0.8 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為丙酮），渦旋混勻1 min后置于60 ℃恒溫水浴中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應(yīng)15 min。取出，冷卻至室溫，于每個(gè)離心管中加入1 mL水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入3 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出上層有機(jī)相，再萃取一次，合并乙酸乙酯萃取液，40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL甲醇渦旋振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm濾膜針頭濾器過(guò)濾于進(jìn)樣小瓶，待測(cè)定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別移取1 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，操作同樣品的衍生步驟并進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 mm；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：超純水；采用梯度洗脫，經(jīng)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，最終確定本研究最佳洗脫程序見(jiàn)表1。流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0、SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。每組平行3 次，測(cè)定結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

表2 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中不同添加量的5 種生物胺的RSD（n=3）Table 2 RSDs for 5 biogenic amines at 5.0, 10.0 and 15.0 mg/L (n= 3)

東北農(nóng)家醬中含有蛋白質(zhì)、脂肪、游離氨基酸及其他復(fù)雜成分，這些成分的存在影響生物胺的有效分離和準(zhǔn)確定量。故合適的前處理方法，可以降低雜質(zhì)含量，降低干擾，得到較高的回收率，提高靈敏度。常見(jiàn)的提取劑有酸性介質(zhì)和有機(jī)介質(zhì)。對(duì)于肉類、水產(chǎn)品及植物性食品中生物胺的提取一般以鹽酸[23]、高氯酸[24]、三氯乙酸[25]等酸性介質(zhì)提取，但5%三氯乙酸在這類樣品中沉淀蛋白效果好于鹽酸；而在奶酪中鹽酸對(duì)生物胺的提取效果較好[26]。提取劑種類的選擇與所分析的樣品基質(zhì)特性有關(guān)，故本研究選取0.1 mol/L鹽酸、5%三氯乙酸和無(wú)水乙醇進(jìn)行對(duì)比，在5.0、10.0、15.0 mg/L三種不同添加水平下對(duì)東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖1～3。

圖1 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量5.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n= 3）Fig. 1 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 5.0 mg/L (n = 3)

當(dāng)5 種生物胺添加量為5.0 mg/L時(shí)，三氯乙酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為85.7%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不高于6.1%；鹽酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為79.1%～99.2%，RSD不高于8.2%；無(wú)水乙醇對(duì)5 種生物胺的提取回收率為60.5%～98.4%，RSD不高于10.3%。其中三氯乙酸對(duì)β-苯乙胺、酪胺、亞精胺的回收率均高于鹽酸和無(wú)水乙醇對(duì)這3 種生物胺的回收率，差異性顯著（P＜0.05），無(wú)水乙醇對(duì)腐胺的提取回收率高于三氯乙酸和鹽酸，但是其對(duì)組胺的回收率為60.5%，遠(yuǎn)低于另外兩種提取劑。

圖2 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量10.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n=3）Fig. 2 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 10.0 mg/L(n = 3)

當(dāng)5 種生物胺添加量為10.0 mg/L時(shí)，三氯乙酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為84.2%～101.6%，RSD不大于6.0%；鹽酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為60.7%～95.0%，RSD不大于9.3%；無(wú)水乙醇對(duì)5 種生物胺的提取回收率為50.2%～78.9%，RSD不大于16.9%。三氯乙酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率均高于鹽酸和無(wú)水乙醇，差異性顯著（P＜0.05），且RSD均低于另外兩種提取劑，回收率及精密度均符合檢測(cè)要求，而無(wú)水乙醇提取5 種生物胺的RSD高于10%，并不符合檢測(cè)要求。

圖3 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量15.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n= 3）Fig. 3 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 15.0 mg/L (n = 3)

當(dāng)5 種生物胺添加量為15.0 mg/L時(shí)，三氯乙酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為80.7%～96.2%，RSD不大于5.5%；鹽酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率為65.1%～90.2%，RSD不大于8.4%；無(wú)水乙醇對(duì)5 種生物胺的提取回收率為52.7%～70.4%，RSD不大于20.4%。三氯乙酸對(duì)5 種生物胺的提取回收率均高于鹽酸和無(wú)水乙醇，差異性顯著（P＜0.05），且RSD均低于另外兩種提取劑，回收率及精密度均符合檢測(cè)要求，而鹽酸對(duì)生物胺的提取回收率相對(duì)于三氯乙酸較低，不符合檢測(cè)要求，無(wú)水乙醇RSD高于10%，沒(méi)有良好的重復(fù)性，同樣不符合檢測(cè)要求。

綜上，在5.0、10.0、15.0 mg/L的添加水平下，三氯乙酸對(duì)5 種生物胺提取回收率分別為85.7%～102.3%、84.2%～101.6%和80.7%～96.2%，RSD分別不大于6.1%、6.0%和5.5%?；厥章屎途芏染蠙z測(cè)要求，可以說(shuō)明三氯乙酸是一種提取東北農(nóng)家醬中生物胺的理想溶劑。且三氯乙酸對(duì)東北農(nóng)家醬的處理時(shí)間只需30 min，從整體提取效果來(lái)看，三氯乙酸提取具有操作簡(jiǎn)單快速、回收率相對(duì)較高的優(yōu)點(diǎn)，是分析東北農(nóng)家醬中生物胺的一種較為理想的提取溶劑。

2.2 衍生劑的選擇及用量

生物胺自身沒(méi)有熒光或紫外發(fā)光基團(tuán)，且其屬于極性分子，需經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行衍生來(lái)提高其在柱子中的溶解性，使其極性得到降低，才能對(duì)其含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。生物胺衍生劑有苯甲酰氯、丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、熒光胺、N-羥基丁二酰亞胺酯類化合物等，目前最常使用的衍生劑是丹磺酰氯和鄰苯二甲醛。但鄰苯二甲醛和生物胺反應(yīng)后需立即測(cè)定，存在反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，而丹磺酰氯與單胺和二胺均可反應(yīng)，且反應(yīng)后產(chǎn)物穩(wěn)定，有較強(qiáng)的紫外吸收等優(yōu)點(diǎn)。董偉峰等[27]將丹磺酰氯和生物胺反應(yīng)后的衍生物放置－20 ℃避光環(huán)境6 個(gè)月后發(fā)現(xiàn)其成分無(wú)太大變化。故選擇丹磺酰氯作為衍生劑，并對(duì)其最適衍生用量進(jìn)行研究，分別添加2、4、6、8、10 mg/mL丹磺酰氯的丙酮溶液與質(zhì)量濃度為50 mg/L的生物胺混標(biāo)溶液進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 丹磺酰氯添加量對(duì)生物胺衍生物生成量的影響Fig. 4 Effects of addition level of sulfonyl chloride on the production of biogenic amine derivatives

由圖4可以看出，隨著丹磺酰氯添加量的增加，5 種生物胺衍生物也在不斷增加，當(dāng)?shù)せ酋Ｂ忍砑恿繛?.8 mL時(shí)，衍生物峰面積達(dá)到最大，且隨著衍生劑用量的增加，衍生物的量并未明顯增加，當(dāng)衍生劑用量為1.0 mL時(shí)，組胺衍生物達(dá)最大量，但與丹磺酰氯添加量為0.8 mL時(shí)并無(wú)顯著差異（P＞0.05），考慮到衍生劑過(guò)量會(huì)對(duì)生物胺色譜圖產(chǎn)生干擾，故選擇0.8 mL作為衍生劑的最適用量。

2.3 衍生物萃取劑的選擇

本研究使用丹磺酰氯進(jìn)行樣品衍生化處理，過(guò)程中加入堿性緩沖溶液，使衍生物溶液中含有無(wú)機(jī)鹽；而東北農(nóng)家醬基質(zhì)復(fù)雜，并且衍生后生物胺衍生物存在渾濁現(xiàn)象，為避免檢測(cè)中色譜柱受到雜質(zhì)損害并保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本研究選擇三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚作為衍生物萃取劑對(duì)東北農(nóng)家醬樣品中的生物胺進(jìn)行進(jìn)一步的富集純化，結(jié)果見(jiàn)圖5。衍生物萃取結(jié)果表明，這3 種溶劑均可將生物胺衍生物萃取出來(lái)，但經(jīng)三氯甲烷和乙醚萃取的生物胺衍生物，峰形均不正常且存在峰沒(méi)有完全分離的現(xiàn)象，這可能是由于東北農(nóng)家醬樣品經(jīng)衍生后還產(chǎn)生其他一些物質(zhì)，乙酸乙酯只能將生物胺衍生物萃取出來(lái)，而乙醚和三氯甲烷可能將生物胺衍生物和其他物質(zhì)一同萃取出來(lái)[28]。并且使用氮?dú)獯蹈奢腿r(shí)，三氯乙酸的揮發(fā)速度明顯低于另外兩種萃取劑；而又因?yàn)橐颐讯拘愿哂谝宜嵋阴?，綜合考慮，選擇乙酸乙酯作為本研究的生物胺衍生物萃取劑。

圖5 乙酸乙酯（A）、乙醚（B）、三氯甲烷（C）萃取生物胺衍生物的圖譜Fig. 5 HPLC chromatograms of ethyl acetate (A), ether (B), and chloroform (C) extracts of biogenic amine derivatives

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

圖6 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（A）和東北農(nóng)家醬（B）中生物胺色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of biogenic amine standards (A) and biogenic amines from soybean paste (B)

由圖6A可知，5 種生物胺在40 min內(nèi)可以完全分離，且峰形對(duì)稱。東北農(nóng)家醬樣品中生物胺色譜圖見(jiàn)圖6B。以生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性范圍；將加標(biāo)樣品逐漸稀釋，衍生后進(jìn)樣，以3 倍信噪比作為檢出限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 生物胺的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations for biogenic amines

由表3可知，5 種生物胺在1～50 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2不小于0.99，峰面積和生物胺含量之間具有顯著線性相關(guān)。檢出限在0.02～0.06 mg/kg之間，該方法靈敏度高，可以滿足生物胺測(cè)定的要求。

2.5 重復(fù)性、精密度及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取同一東北農(nóng)家醬樣品經(jīng)衍生后連續(xù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)定5 次，RSD低于5%，表明該方法重復(fù)性良好，精密度良好，達(dá)到分析要求，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方法的精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）Table 4 Results of precision tests (n= 5)

=3）Table 5 Recoveries of biogenic amines from spiked sample (n= 3)表5 生物胺加標(biāo)回收率的測(cè)定（n

選取東北同一農(nóng)家醬樣品，在線性范圍內(nèi)選取5.0、10.0、15.0 mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)衍生后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定，得平均加標(biāo)回收率在82.23%～104.87%之間，RSD在1.56%～4.28%（n=3）之間，符合檢測(cè)要求，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

表6 市售東北農(nóng)家醬中生物胺含量Table 6 Contents of 5 biogenic amines in farmhouse soybean paste samples from northeastern China mg/kg

由表6可知，不同東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺含量不盡相同，這可能是由于不同東北農(nóng)家醬的發(fā)酵環(huán)境不同導(dǎo)致的?？傮w來(lái)說(shuō)，組胺、腐胺、亞精胺和β-苯乙胺在6 種樣品中均檢測(cè)到，其中1 種樣品中未檢測(cè)到酪胺。6 種樣品生物胺總含量范圍為25.41～444.93 mg/kg，其中對(duì)人體危害較大的組胺和酪胺含量分別在1.67～68.98 mg/kg和0～5 0.3 2 m g/k g之間，腐胺含量范圍為4.98～103.82 mg/kg，亞精胺含量范圍為7.80～102.21 mg/kg，β-苯乙胺含量范圍為5.27～150.62 mg/kg。

在東北農(nóng)家醬發(fā)酵過(guò)程中，大量的環(huán)境微生物進(jìn)入其中。其發(fā)酵過(guò)程具有不確定性和隨意性，且自然發(fā)酵周期長(zhǎng)，微生物發(fā)揮較大作用。這些微生物既有有益微生物，又有有害微生物，都存在產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的可能性，如若有害微生物含量存在過(guò)多，產(chǎn)胺微生物對(duì)其中氨基酸利用的比較徹底，導(dǎo)致東北農(nóng)家醬中生物胺含量的增高。歐洲食品安全管理局證實(shí)組胺和酪胺毒性最大，特別與食品安全有關(guān)[29]。斯洛伐克共和國(guó)營(yíng)養(yǎng)法典[30]確定了以下兩種生物胺的最大耐受限量：組胺（啤酒為20 mg/kg，魚(yú)和魚(yú)制品為200 mg/kg）和酪胺（200 mg/kg）。且荷蘭乳制品研究所和捷克建議肉制品中組胺的推薦上限為100～200 mg/kg。由此可知，東北農(nóng)家醬中的生物胺對(duì)人體存在潛在的安全問(wèn)題，監(jiān)測(cè)東北農(nóng)家醬中生物胺含量及微生物的存在情況和以生物胺為檢測(cè)指標(biāo)建立東北農(nóng)家醬的安全評(píng)價(jià)體系勢(shì)在必行。

3 結(jié) 論

本研究建立的高效液相色譜法適用于東北農(nóng)家醬中5 種生物胺的測(cè)定。該方法線性范圍較廣、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，能快速簡(jiǎn)便地對(duì)東北農(nóng)家醬中的生物胺進(jìn)行檢測(cè)分析。使用本研究建立的高效液相色譜法測(cè)定不同市售東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺，其含量存在較大差異，故在東北農(nóng)家醬生產(chǎn)中應(yīng)注意控制其發(fā)酵環(huán)境，減少微生物的污染，從而進(jìn)一步控制東北農(nóng)家醬發(fā)酵過(guò)程中存在的生物胺。且東北農(nóng)家醬發(fā)酵過(guò)程中生物胺的形成機(jī)制和變化規(guī)律尚不明確，有待日后進(jìn)一步深入研究。