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      基于正交試驗的風(fēng)濕寧膠囊提取純化工藝研究

      2019-09-06 06:10:08董晨虹王鵬飛段秀俊
      關(guān)鍵詞:青風(fēng)藤青藤轉(zhuǎn)移率

      劉 培,葉 花,董晨虹,王鵬飛,王 科,段秀俊

      (山西中醫(yī)藥大學(xué),山西晉中030619)

      風(fēng)濕病是一組侵犯關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉、血管及有關(guān)軟組織或結(jié)締組織為主的疾病,其中多數(shù)為自身免疫性疾病,臨床上主要表現(xiàn)為慢性、進行性、對稱性病理改變??赡芘c環(huán)境、感染和遺傳等因素有關(guān),但其疾病機制尚未完全明確,其發(fā)病多較隱蔽而緩慢,病程較長,且大多具有遺傳傾向,診斷及治療均有一定難度。中醫(yī)藥在治療風(fēng)濕病方面有很大優(yōu)勢,近年來,初步闡明了很多中藥的有效成分和作用機制,不斷涌現(xiàn)出新的治療藥物,在改善患者生活質(zhì)量、緩解疼痛、減少致殘率、減輕藥物副作用方面有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義[1-2]。

      風(fēng)濕寧膠囊為山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑,由羌活、獨活、青風(fēng)藤、威靈仙、片姜黃、防風(fēng)、川芎、麻黃、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黃、砂仁、生姜和甘草17味中藥組成,主要用于治療風(fēng)寒濕邪痹阻經(jīng)絡(luò)所致類風(fēng)濕性及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。本課題屬國家科技部重大專項重大新藥創(chuàng)制項目,前期課題組已經(jīng)對風(fēng)濕寧膠囊對風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3-7]、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[8-10]的抗炎作用及機制做了大量研究,同時課題組對風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了研究,建立了獨活、青風(fēng)藤、血竭及肉桂的薄層鑒別方法以及青風(fēng)藤及血竭含量的測定方法[11]。風(fēng)濕寧膠囊中除血竭外的16味藥水煎液均具有不同程度的抗炎、鎮(zhèn)痛或免疫抑制等與治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相應(yīng)的藥理活性[12-17],故16味藥的提取方法選擇了水煎煮,含揮發(fā)性成分的藥材先采用水蒸汽蒸餾法收集揮發(fā)油[18],血竭粉碎入藥。為減少服用量,工藝純化選擇了醇沉淀法。采用正交試驗法對風(fēng)濕寧膠囊的水提醇沉工藝條件進行優(yōu)選,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

      1 儀器與試藥

      1.1 實驗儀器

      Dionex高效液相色譜儀,PDA-100 Photodiode Array Detector檢測器,ASI-100Automated Sample Injector,Chromeleon 6 色譜工作站,DiamonsilC18(2)(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱;METTLER TOLEDO AB135-S型十萬分之一天平,HANPING FA2104型萬分之一電子天平;SB-5200 DTDN超聲波清洗器(寧波新藝生物科技股份有限公司),容量瓶,錐形瓶。

      1.2 藥材與試劑

      青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.的干燥藤莖,羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang的干燥根莖及根,獨活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根,川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖,威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根莖及根,防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata Schischk.的干燥根等,以上藥材均由山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品。青藤堿(批號0774-200206,供含量測定用)化學(xué)對照品購自中國藥品生物制品檢定所。色譜測定用甲醇為色譜純,水為純凈水,其他所用試劑均為分析純。

      2 方法

      2.1 青藤堿的含量測定方法

      2.1.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilC18(2)柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:甲醇-0.1%三乙胺(35∶65);檢測波長 262 nm;柱溫 30 ℃[11]。

      2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的對照品青藤堿,加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液,搖勻,0.45 μm的濾膜濾過,即得。

      2.1.3 供試品溶液的制備 取提取物干浸膏粉約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%的甲醇溶液20 mL,超聲處理20 min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得。

      2.1.4 測定法 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定。色譜圖見圖1。

      圖1 風(fēng)濕寧膠囊青藤堿測定液相色譜圖

      2.2 工藝條件考察[19-22]

      2.2.1 提取工藝條件考察 選擇青藤堿作為考察對象,以青藤堿轉(zhuǎn)移率為考核指標(biāo),選擇加水量、煎煮時間以及煎煮次數(shù)作為考察因素,每個因素選擇了3個水平(因素水平設(shè)定見表1),采用L9(34)正交表安排實驗。

      表1 提取工藝考察因素水平表

      2.2.2 純化工藝條件考察 按處方比例稱取各藥適量,按上述最佳煎煮工藝條件,加水煎煮,合并煎液,平均分成9份,仍以青藤堿轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo),對影響醇沉效果的3個主要因素藥液的濃縮程度、醇沉濃度以及醇沉?xí)r間進行考察,每因素設(shè)定3水平(因素水平設(shè)定見表2),仍采用L9(34)正交表安排實驗。

      表2 純化工藝考察因素水平表

      3 結(jié)果與分析

      3.1 提取工藝條件的優(yōu)選結(jié)果與分析

      按處方比例稱取各藥味適量,共9份,按照正交表設(shè)定的試驗條件分別進行煎煮,將所得煎液濃縮至稠膏,烘干。測定干膏中青藤堿的含量,計算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表3、表4。

      從統(tǒng)計分析結(jié)果看,A為不顯著因素,Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ;B為不顯著因素,Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ;C為顯著性因素,且Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ。即A2B2C2為最佳方案,而從實際試驗結(jié)果看A2B3C2應(yīng)為最佳方案。將兩種方案各重復(fù)試驗3次,從試驗結(jié)果看兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義,故從省時節(jié)能的角度選擇A2B2C2為最佳方案。

      表3 提取工藝考察正交試驗結(jié)果

      表4 提取工藝考察方差分析結(jié)果

      3.2 純化工藝條件的優(yōu)選結(jié)果與分析

      將所得藥液回收乙醇,濃縮至稠膏,烘干。測定各干膏中青藤堿的含量,計算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表5、表 6。

      表5 純化正交試驗結(jié)果

      表6 純化方差分析結(jié)果

      從統(tǒng)計分析結(jié)果看,A為顯著因素,Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ;B為不顯著因素,Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ;C為不顯著因素,Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ,即A3B1C1為最佳組合。實際試驗結(jié)果也是A3B1C1為最佳組合。故選擇A3B1C1為最佳方案。

      4 討論

      研究結(jié)果表明,水煎煮最佳工藝條件為加水量10倍,煎煮時間為1 h,煎煮次數(shù)為2次,青藤堿轉(zhuǎn)移率約65%;醇沉淀最佳工藝條件為濃縮至1∶1.1,醇沉濃度為60%,時間為12 h,青藤堿轉(zhuǎn)移率約63%,中試驗結(jié)果表明,優(yōu)選的工藝條件基本合理。

      曾考慮采用多指標(biāo)手段對工藝條件進行篩選,初步考慮以羌活與防風(fēng)中所含紫花前胡苷、威靈仙中所含常春藤皂苷元及青風(fēng)藤中所含青藤堿的綜合轉(zhuǎn)移率優(yōu)選最佳工藝條件,這樣可以兼顧各類成分的提取率。但由于本處方藥味多,實驗中除青藤堿外,紫花前胡苷與常春藤皂苷元均難以排除干擾,故選擇青藤堿作為工藝考察指標(biāo)。

      水提醇沉淀的工藝路線是通過藥效試驗結(jié)果確定的,其抗炎止痛效果較優(yōu)。本實驗結(jié)果為風(fēng)濕寧膠囊的制劑開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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