肝螺桿菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

馮 潔 ，張 泉 ，錢 淼 ，謝建云 ，胡建華 ，高 誠(chéng) ，高 崧

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心 上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海201203）

肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus，H. hepaticus）是一種革蘭氏陰性、微需氧、螺旋彎曲狀細(xì)菌，最早由美國(guó)國(guó)家癌癥研究院Fox等[1]在雌性A／JCr小鼠的肝細(xì)胞癌和慢性活動(dòng)性肝炎的肝組織中發(fā)現(xiàn)。該菌呈世界性分布，已從多種哺乳動(dòng)物的胃腸道和肝組織中成功分離，可引起宿主多種肝腸疾病，影響動(dòng)物健康，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2-5]。國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)普遍要求實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠須排除該病原體。我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未將其納入微生物控制列表，2017年中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)制定發(fā)布團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)并將螺桿菌列入其中，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌的PCR檢測(cè)方法，適用范圍包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其產(chǎn)品、細(xì)菌培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及動(dòng)物源性生物制品中螺桿菌的檢測(cè)，這對(duì)于我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量保證和提升起到了促進(jìn)作用。目前該菌的檢測(cè)方法主要是分離培養(yǎng)和PCR檢測(cè)等手段，隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和標(biāo)準(zhǔn)化要求的不斷提高，建立快速、準(zhǔn)確、適宜推廣的肝螺桿菌檢測(cè)方法尤為必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等[6]報(bào)道的一種快速核酸擴(kuò)增技術(shù)。特點(diǎn)在于恒溫條件下利用特異性引物及鏈置換DNA聚合酶的作用對(duì)模板進(jìn)行高效擴(kuò)增。該技術(shù)特異性好、靈敏度高、高效簡(jiǎn)便，反應(yīng)結(jié)果可通過反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀進(jìn)行肉眼觀察直接判定，無需特殊、昂貴儀器，適宜基層推廣，近年來在疾病診斷、食品安全等方面得到廣泛應(yīng)用[7]。鞭毛蛋白B（fla B基因編碼）是肝螺桿菌的重要毒力因子，保守性強(qiáng)，本研究針對(duì)fla B保守區(qū)域設(shè)計(jì)一組特異性引物，目的在于建立一種快速、特異、靈敏的肝螺桿菌LAMP檢測(cè)方法，為肝螺桿菌的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株肝螺桿菌ATCC 51449、膽型螺桿菌ATCC 51630、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 27853、嗜肺巴斯德桿菌ATCC35149、嚙齒檸檬酸桿菌ATCC 51116、牛棒狀桿菌ATCC 7715均購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；肺炎克雷伯桿菌CMCC 46117、鼠傷寒沙門氏菌 CMCC50115、福氏志賀菌CMCC 51572、糞產(chǎn)堿桿菌CMCC 40001均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)譜生物科技有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker購(gòu)自TAKARA公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Bio-west公司；GoldViewTM核酸染料購(gòu)自上海賽百盛（SBS）基因技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的肝螺桿菌fla B基因序列，利用LAMP在線設(shè)計(jì)軟件針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1套LAMP引物，包括2條外引物、2條內(nèi)引物和1條環(huán)引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表1中F3/B3為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增外引物，F(xiàn)IP/BIP為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增內(nèi)引物，LB為環(huán)引物。

表1 LAMP擴(kuò)增引物序列Table 1 LAMP primer sequences

1.4 基因組DNA提取按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)菌基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280在1.6～2.0范圍內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP方法的建立與優(yōu)化25 μL LAMP反應(yīng)體系：5 μmol/L的外引物F3/B3各1 μL；40 μmol/L的內(nèi)引物FIP/BIP各1 μL，20 μmol/L的反向環(huán)引物L(fēng)B 1 μL，2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，BstDNA聚合酶1 μL，熒光染料1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL體系。設(shè)未加入模板的體系作為陰性對(duì)照。將反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）內(nèi)反應(yīng)并繪制曲線，曲線上升表示發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)即為陽性。為確保反應(yīng)精確性，分別在59℃、61℃、63℃、65℃、67℃擴(kuò)增溫度下，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為30～75 min，對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物可經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或通過熒光染料目測(cè)觀察。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶則判為陽性，未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶則判為陰性。在LAMP反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)管目測(cè)出現(xiàn)綠色熒光判為陽性，橙色則判為陰性。

1.6 LAMP特異性檢測(cè)以肝螺桿菌基因組DNA為陽性對(duì)照模板，滅菌ddH2O為陰性對(duì)照模板，膽型螺桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌和糞產(chǎn)堿桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.7 LAMP靈敏度檢測(cè)將肝螺桿菌基因組DNA模板進(jìn)行10倍倍比稀釋，對(duì)不同濃度的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以確定最低檢測(cè)限。同時(shí)采用中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CALAS 24-2017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌PCR檢測(cè)方法[8]進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度差異。

1.8 臨床應(yīng)用無菌采集52只SPF級(jí)小鼠回盲部?jī)?nèi)容物0.2 g，懸浮于1 mL PBS（pH7.4）中制成懸液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。分別采用本文建立的LAMP檢測(cè)方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立為優(yōu)化擴(kuò)增條件，對(duì)不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行摸索。在選定的不同擴(kuò)增溫度下，30～75 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)陽性核酸擴(kuò)增效率和陽性核酸出峰時(shí)間差別不大，故選擇63℃擴(kuò)增溫度、45 min反應(yīng)時(shí)間作為最佳反應(yīng)條件。如圖1所示，采用本研究建立的LAMP擴(kuò)增體系對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果經(jīng)電泳檢測(cè)可見典型梯狀條帶，陰性對(duì)照未見條帶。初步表明本研究建立的LAMP擴(kuò)增方法可行。

圖1 肝螺桿菌LAMP擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)Fig.1 LAMP detection of H. hepaticus

2.2 LAMP特異性檢測(cè)分別以膽型螺桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、糞產(chǎn)堿桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，肝螺桿菌基因組DNA為陽性對(duì)照模板，滅菌純凈水為陰性對(duì)照模板，結(jié)果見圖2、3。如圖2所示，僅肝螺桿菌出現(xiàn)上升性擴(kuò)增曲線，說明發(fā)生特異性擴(kuò)增，而其他菌株均未出現(xiàn)擴(kuò)增，表明建立的LAMP檢測(cè)方法特異性良好。

圖2 特異性試驗(yàn)LAMP擴(kuò)增圖Fig.2 LAMP ampli fication of speci ficity test

2.3 LAMP靈敏度檢測(cè)以8.69 μg/μL的肝螺桿菌基因組DNA為起始濃度，按10倍倍比稀釋后進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示本研究建立的LAMP方法能夠檢出的最低模板量為86.9 fg/μL（圖4）。常規(guī)PCR方法能夠檢出的最低模板量為869 fg/μL（圖5）。

2.4 臨床應(yīng)用應(yīng)用本文建立的LAMP檢測(cè)方法和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)推薦PCR方法對(duì)52份樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，LAMP陽性檢出率為88.46%（46/52），常規(guī)PCR陽性檢出率為80.77%（42/52），LAMP方法的陽性檢出率較常規(guī)PCR高7.69%，二者符合率為92.31%。

3 討論

肝螺桿菌是一種重要的人獸共患病原體，主要以隱性感染方式定植于動(dòng)物下消化道（盲腸、結(jié)腸、肝膽管系統(tǒng)），呈宿主依賴型，可引起慢性肝炎、盲腸結(jié)腸炎、膽肝炎甚至肝癌、肝膽管腺瘤、結(jié)腸癌等病變，影響小鼠免疫應(yīng)答，可刺激宿主肝臟巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和單核淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ、IFN-α/β、IL-6、IL-8、IL-17等[9-11]，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，被公認(rèn)為是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要致病菌[12]。近年來圍繞肝螺桿菌與人類疾病尤其是肝膽疾病的相關(guān)研究已開展。報(bào)道顯示，在慢性病毒性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌患者的癌組織中可擴(kuò)增出螺桿菌16S rRNA基因片段，推測(cè)肝螺桿菌可能與人類肝臟疾病的發(fā)展有關(guān)聯(lián)，可能會(huì)增加已被乙型或丙型肝炎病毒感染患者的癌變率[13-16]。由于肝螺桿菌存在潛在的人與動(dòng)物交叉?zhèn)鞑サ闹虏⌒訹17]，因此對(duì)于動(dòng)物質(zhì)量控制以及公共衛(wèi)生而言，建立可靠的肝螺桿菌快速檢測(cè)方法具有重要意義。

圖3 LAMP特異性試驗(yàn)Fig.3 Speci ficity test of LAMP

圖4 LAMP敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of LAMP

圖5 PCR敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensitivity test of PCR

表2 LAMP和PCR方法的比較Table 2 Comparison of LAMP and PCR

肝螺桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要為分離培養(yǎng)、血清學(xué)和PCR等分子生物學(xué)方法。分離培養(yǎng)是細(xì)菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法根據(jù)細(xì)菌生物學(xué)特性、表型特征進(jìn)行鑒定，但存在操作繁瑣、周期長(zhǎng)、敏感性低等缺陷。肝螺桿菌為微需氧菌，營(yíng)養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢且在體外穩(wěn)定性差，通常需2～3周才能獲得檢測(cè)結(jié)果，敏感性差。經(jīng)初次分離后傳代培養(yǎng)時(shí)易發(fā)生球形裂變或絲狀體，處于休眠狀態(tài)呈現(xiàn)非可培養(yǎng)活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)菌死亡或帶菌量很少時(shí)通常造成漏檢[18-19]，故培養(yǎng)法不適于該菌的快速檢測(cè)和大批量樣品篩查。血清學(xué)方法主要是檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體。該方法操作簡(jiǎn)便、高效，可在同一時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，但對(duì)抗原制備要求高，由于不同血清型螺桿菌之間抗原同源性較高，易出現(xiàn)非特異性結(jié)合造成假陽性結(jié)果[20]。常規(guī)分子生物學(xué)方法如PCR等，具備快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，已在病原體快速診斷中得到廣泛應(yīng)用，尤其是培養(yǎng)方法受限的病原體更為適合。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)普遍采用PCR方法對(duì)肝螺桿菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但PCR檢測(cè)過程需昂貴的擴(kuò)增儀等設(shè)備支持，限制了該方法在一線現(xiàn)場(chǎng)的推廣應(yīng)用。LAMP利用一種鏈置換DNA聚合酶（BstDNA polymerase）和2對(duì)特殊引物，特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在等溫條件下（65℃左右）保溫?cái)?shù)10 min，即可完成核酸擴(kuò)增。該技術(shù)因具備簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異、易于推廣等優(yōu)勢(shì)，尤其適合于野外現(xiàn)場(chǎng)使用，已廣泛應(yīng)用于病原體的快速檢測(cè)和早期診斷[21-23]。

本研究針對(duì)肝螺桿菌鞭毛蛋白B基因（fla B）保守區(qū)域設(shè)計(jì)一組LAMP擴(kuò)增特異性的引物，對(duì)新建LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行特異性和敏感性分析。鞭毛抗原，又稱H抗原，不僅決定了細(xì)菌在細(xì)胞表面的吸附、侵襲和定居過程，還是細(xì)菌重要的表面抗原，是肝螺桿菌重要的毒力因子。目前已知肝螺桿菌Hh的鞭毛合成系統(tǒng)編碼兩種類型的鞭毛蛋白A和B，fla B編碼514個(gè)氨基酸組成多肽。有研究表明，不同菌株間鞭毛蛋白的同源性很高，具有很高的保守性，可以作為Hh診斷的候選基因之一[24-25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP擴(kuò)增在恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)即可完成檢測(cè)，特異性好，靈敏度較常規(guī)PCR高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可直接通過肉眼實(shí)現(xiàn)可視化觀察，無需開蓋進(jìn)行電泳，即節(jié)省時(shí)間又可避免核酸污染檢測(cè)場(chǎng)所。臨床樣本應(yīng)用試驗(yàn)顯示本文建立的LAMP方法敏感性較PCR方法高，PCR方法檢測(cè)呈陽性的樣品均能被LAMP方法檢測(cè)出，二者符合率達(dá)92.31%。

綜上，本研究建立了肝螺桿菌LAMP快速檢測(cè)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法不受培養(yǎng)條件和檢測(cè)儀器的限制，具備簡(jiǎn)便、快捷、特異、靈敏的優(yōu)勢(shì)，結(jié)果可視化，適宜基層推廣應(yīng)用，為肝螺桿菌的快速檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。