快速檢測(cè)炭疽桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及評(píng)價(jià)

杜清春，董珊珊，丁奕博，張 艷，李 偉，王 鵬

（1. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理 671000；2. 云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000；3. 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206）

炭疽是由炭疽桿菌（Bacillus anthracis，B.anthracis）感染而引起的自然疫源性和人獸共患傳染病，炭疽桿菌為革蘭陽性桿菌[1-2]。在空氣中容易形成芽孢[2-3]，即使在惡劣的環(huán)境中依然可以存活數(shù)十年甚至更久[4-6]，在條件適宜時(shí)重新萌發(fā)生長(zhǎng)，因此常被用作生物戰(zhàn)劑[1-2]。炭疽桿菌的致病因子主要有炭疽毒素和莢膜，分別由炭疽桿菌的質(zhì)粒pXO1和pXO2編碼[1,5,7]。Rayer于1850年在被感染的綿羊血液中發(fā)現(xiàn)了炭疽桿菌，它是人類歷史上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的病原菌[8-9]，其感染人和動(dòng)物的途徑主要有皮膚直接接觸感染、消化道感染和呼吸系統(tǒng)感染[9]，人和動(dòng)物感染炭疽桿菌后的致病類型主要有皮膚炭疽、腸炭疽和肺炭疽。其中皮膚炭疽約占炭疽病的95%左右，是最常見的炭疽?。环翁烤沂亲顬閲?yán)重的臨床類型，常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽和胸痛等，引起肺功能減退甚至死亡，目前較為少見[10]。檢測(cè)炭疽桿菌的技術(shù)主要有細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)[5]。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)如病原的分離培養(yǎng)和鑒定[11]；血清學(xué)檢測(cè)如熒光量子點(diǎn)免疫標(biāo)記法[12]、分子生物學(xué)檢測(cè)如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13-14]、普通PCR擴(kuò)增技術(shù)[15-17]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）技術(shù)等[18,19-22]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于炭疽桿菌的檢測(cè)，主要依據(jù)pagA、cap和rpoB3個(gè)靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)引物和探針。pagA和cap基因分別位于質(zhì)粒pXO1和pXO2上，在遺傳過程中會(huì)發(fā)生丟失，具有不穩(wěn)定性；rpoB基因位于炭疽桿菌的染色體上，其基因組序列和蠟樣芽孢桿菌高度相似，會(huì)有交叉反應(yīng)[23]，不宜用于炭疽桿菌的檢測(cè)。雖然血清學(xué)方法為炭疽的主要診斷技術(shù)，但其特異性和靈敏度相對(duì)于RT-PCR技術(shù)不占優(yōu)勢(shì)，且血清學(xué)方法在炭疽感染初期不易檢出抗體?；谝陨锨闆r，本研究根據(jù)位于炭疽桿菌染色體上的TJHP和BA5345 2個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，以期建立能在感染初期特異檢出炭疽桿菌的方法。

1 材料與方法

1.1 陽性菌株和陰性菌株DNA實(shí)驗(yàn)中所用到的10份炭疽芽孢桿菌DNA（其中A16R為疫苗株，其余9份為標(biāo)準(zhǔn)株）由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供；陰性對(duì)照菌株DNA由云南省地方病防治所中心實(shí)驗(yàn)室保存。陰性對(duì)照菌株信息見表1。

表1 陰性對(duì)照菌株Table 1 Negative control strains

1.2 主要試劑TaqProbe qPCR 2 × real-time Mix、細(xì)菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；炭疽桿菌（cap/rpoB/pag）單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

(續(xù)上表)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法利用4對(duì)引物檢測(cè)10份炭疽桿菌DNA和對(duì)照菌株DNA，再進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)，最后選擇分別針對(duì)TJHP和BA5345 2個(gè)靶點(diǎn)且特異性和靈敏度較好的2對(duì)引物及其探針進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用炭疽桿菌（cap/rpoB/pag）單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒做對(duì)比試驗(yàn)。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值評(píng)價(jià)所選擇的2對(duì)引物及其探針的特異性和靈敏度，建立快速檢測(cè)炭疽桿菌的方法。

1.3.1 設(shè)計(jì)并合成引物和探針 根據(jù)炭疽桿菌染色體上的2個(gè)靶點(diǎn)TJHP和BA5345堿基序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)4對(duì)引物和2個(gè)探針，并送至上海輝睿生物科技有限公司合成。引物和探針序列見表2。

表2 4對(duì)引物及其探針序列Table 2 Primer and probe sequences

1.3.2 提取細(xì)菌DNA 按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明提取炭疽桿菌和陰性對(duì)照菌株DNA。

1.3.3 建立快速檢測(cè)炭疽桿菌的qPCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系：2×real-time Mix 10 μL，ddH2O 6.8 μL，上下游引物和探針（濃度均為0.1 nmol/μL）各0.4 μL，模板DNA 2 μL。擴(kuò)增條件：95℃變性2 min；95℃變性20 s，60℃延伸30 s，共40次循環(huán)。反應(yīng)完成后，分析擴(kuò)增曲線和對(duì)應(yīng)Ct值。

1.3.4 特異性檢測(cè) 利用4對(duì)引物分別檢測(cè)10份炭疽桿菌DNA和陰性對(duì)照菌株DNA，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值評(píng)價(jià)4對(duì)引物的特異性。同時(shí)用傳統(tǒng)的炭疽桿菌（cap/rpoB/pag）單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒做對(duì)比試驗(yàn)。

1.3.5 靈敏度檢測(cè) 選擇含量最多的1份炭疽桿菌DNA（其濃度為45.13 ng/μL），按10倍倍比稀釋，稀釋成100～10-910個(gè)濃度，利用4對(duì)引物對(duì)稀釋的炭疽桿菌DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 在同一實(shí)驗(yàn)條件下，挑選特異性和靈敏度較好的2對(duì)引物進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，比較分析兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異。

2 結(jié)果

2.1 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 陽性菌株DNA檢測(cè)結(jié)果 4對(duì)引物及其探針的特異性良好。其Ct值和擴(kuò)增曲線，見表3和圖1。

2.1.2 傳統(tǒng)炭疽桿菌（cap/rpoB/pag）單重?zé)晒釶CR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)同一份炭疽桿菌DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，cap/rpoB/pag3個(gè)靶標(biāo)的Ct值分別為26.61/ 35.01/36.55，其中rpoB基因?qū)ο灅友堪麠U菌DNA有非特異性擴(kuò)增。

表3 4對(duì)引物檢測(cè)10份炭疽桿菌DNA的Ct值Table 3 Ct value of 10 Bacillus anthracis DNA detected

2.1.3 陰性對(duì)照菌株DNA檢測(cè)結(jié)果 4對(duì)引物對(duì)陰性對(duì)照菌株DNA均不擴(kuò)增；rpoB基因與蠟樣芽孢桿菌有交叉反應(yīng)。部分?jǐn)U增結(jié)果如圖2所示。

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果在檢測(cè)炭疽桿菌TJHP和BA5345靶基因的引物中，F(xiàn)P2/RP2和FP4/RP4靈敏度較好，其2對(duì)引物均在10-5稀釋度時(shí)幾乎無擴(kuò)增，在10-4稀釋度時(shí)還能擴(kuò)增，2對(duì)引物能檢測(cè)到的最低DNA濃度約為4.513×10-5ng/μL（圖1）。

圖1 4對(duì)引物檢測(cè)10份炭疽桿菌DNA的擴(kuò)增曲線Fig.1 Ampli fication curves of 10 Bacillus anthracis DNA detected with 4 primers

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，對(duì)兩次結(jié)果的Ct值進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，得到t=1.178，P=0.332，按а=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＞0.05，接受H0，拒絕H1，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，表明所建立的快速檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。

圖2 靈敏度實(shí)驗(yàn)中的部分?jǐn)U增曲線Fig.2 Partial ampli fication curve of negative control strain ropB gene detected with primer FP4/RP4

圖3 FP2/RP2和FP4/RP4 2對(duì)引物的靈敏度擴(kuò)增曲線Fig.3 The sensitivity ampli fication curve of primers FP2/RP2 and FP4/RP4

3 討論

炭疽桿菌的致病因子主要是炭疽毒素和莢膜，分別由質(zhì)粒pXO1和pXO2編碼，故檢測(cè)炭疽桿菌的基因診斷技術(shù)主要依據(jù)這兩個(gè)質(zhì)粒的pagA和cap基因設(shè)計(jì)引物和探針。而本次檢測(cè)方法的建立主要根據(jù)炭疽桿菌染色體上的TJHP和BA5345 2個(gè)靶點(diǎn)共設(shè)計(jì)4對(duì)引物和2條探針。若所設(shè)計(jì)的引物和探針在現(xiàn)場(chǎng)樣品的篩查中能特異地檢出炭疽桿菌，則又進(jìn)一步豐富了炭疽的檢測(cè)技術(shù)，這對(duì)于炭疽的防治工作具有重要意義。

目前，檢測(cè)炭疽桿菌的技術(shù)主要有細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)[24]。雖然分離到病原是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌學(xué)檢測(cè)有耗時(shí)長(zhǎng)、病原分離率低等不足，不利于臨床醫(yī)師做出快速確診，故臨床檢測(cè)中已較少使用，現(xiàn)主要用于流行病學(xué)追蹤調(diào)查等科研活動(dòng)；血清學(xué)檢測(cè)是現(xiàn)階段用于檢測(cè)炭疽桿菌的主要篩查檢測(cè)技術(shù)，但其特異性相對(duì)較弱且靈敏度低，在感染初期因抗體效價(jià)低不易檢出，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性；分子生物學(xué)檢測(cè)起步相對(duì)較晚，但經(jīng)過二十多年發(fā)展已逐漸成熟，PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高，在科學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用[25-27]。其中具有代表性的RT-PCR，不需要像普通PCR進(jìn)行凝膠電泳，降低了被污染的機(jī)率，并且縮短了檢測(cè)時(shí)間，能在2 h之內(nèi)檢出結(jié)果，大大提高了檢測(cè)效率。

在實(shí)際檢測(cè)中，由于RT-PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與其他方法不一致的情況，如RT-PCR為陽性，而血清學(xué)為陰性[28-29]。此時(shí)，不應(yīng)以某一檢測(cè)方法的結(jié)果為最終結(jié)果，而要結(jié)合多種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果作出正確的結(jié)論。

從檢測(cè)結(jié)果可以得知，4對(duì)引物對(duì)10份炭疽桿菌DNA均能特異性擴(kuò)增，而對(duì)陰性對(duì)照菌株DNA無擴(kuò)增，其特異性強(qiáng)于傳統(tǒng)的基因檢測(cè)試劑盒；FP2/RP2和FP4/RP4靈敏度較好，且重復(fù)性好（t=1.178，P=0.332），建立的快速檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。因此，這2對(duì)引物及其探針可用于炭疽桿菌感染初期的快速篩查以及臨床輔助診斷；也可用于炭疽疫情監(jiān)測(cè)中土壤、糞便、毛皮制品等批量樣本的快速篩查。