NDRV σC蛋白互作的宿主因子篩選及生物信息學(xué)分析

肖 容，杜夏夏，李傳峰，馬文戈，米曉云，劉光清，周海龍，陳宗艷

（1.海南大學(xué)農(nóng)林學(xué)院，?？?70228；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.新疆畜牧科學(xué)院，烏魯木齊830000）

禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）屬于呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬，能感染多種禽類，傳播范圍廣泛[1]。禽呼腸孤病毒感染水禽的報道最初僅見于番鴨，稱為番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[2]，研究表明ARV和MDRV對我國的北京鴨以及其他品種鴨不具有感染性[3]。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，呼腸孤病毒病感染不同品種鴨也見報道，但是由于流行區(qū)域、發(fā)病種群和發(fā)病時間的不同，呼腸孤病毒感染鴨表現(xiàn)出不同程度的差異。2008年劉紅等[4]從廣州某處病鴨中分離到1株呼腸孤病毒DRV-GZ株，2009年陳少鶯等[5]發(fā)現(xiàn)1株鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV），此毒株與典型的MDRV在致病性和基因結(jié)構(gòu)上存在差異。2011年，本實(shí)驗(yàn)室通過對安徽太湖縣鴨疫情診斷分析，鑒定該疫情是由新型鴨源呼腸孤病毒引起，命名為NDRV-TH11（Novel duck reovirus，NDRV-TH11）株[6]。與以往報道的DRV相比，NDRV-TH11致病性更強(qiáng)、感染范圍更廣、病死率更高、宿主譜更廣，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，仍然不斷存在NDRV的分離報道[7-9]。

禽呼腸孤病毒無囊膜包被，具有二十四面體雙層衣殼，基因組由10個雙鏈RNA基因片段組成（L1、L2、L3、63 M1、M2、M3、S1、S2、S3和S4），10個基因節(jié)段編碼至少10個結(jié)構(gòu)蛋白（λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB、σC、μBN和μBC)和5個非結(jié)構(gòu)蛋白（μN(yùn)SC、μN(yùn)S、σNS、P10和P17）[10]。σC蛋白是由S1基因節(jié)段編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白，能與宿主細(xì)胞受體特異結(jié)合啟動病毒感染過程，而且該蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生特異性中和抗體，在持續(xù)性免疫選擇壓力下，該編碼基因最容易發(fā)生變異以適應(yīng)比較大的進(jìn)化壓力。此外，σC基因含有侵染宿主細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合位點(diǎn)（Arg-gly-Asp，RGD），是病毒感染的關(guān)鍵因子。

病毒與宿主細(xì)胞之間存在著多種多樣的蛋白相互作用，形成密不可分的蛋白網(wǎng)絡(luò)，這些蛋白網(wǎng)絡(luò)對于調(diào)控病毒復(fù)制、啟動宿主天然免疫反應(yīng)，發(fā)揮著重要的功能。鑒定宿主細(xì)胞蛋白與病毒蛋白之間的相互作用是研究病毒蛋白的功能以及在復(fù)制過程中作用的關(guān)鍵步驟[11]。為了能更深入的了解與σC蛋白相互作用的宿主蛋白，本研究運(yùn)用免疫共沉淀法并結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，篩選出可能與σC蛋白互作的宿主蛋白因子，再結(jié)合GO注釋、KEGG代謝通路注釋，分析預(yù)測這些所篩選出的宿主細(xì)胞蛋白在病毒的復(fù)制和致病過程中所發(fā)揮的作用，以期為防控DRV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒和載體 鴨胚原代成纖維細(xì)胞（duck embryo primary fibroblasts，DEFs）從10日齡鴨胚中制備；真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA由本實(shí)驗(yàn)室保存；NDRV-TH11毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存。

1.1.2 主要試劑 Anti-HA單克隆抗體購自Sigma-Aldrich 公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑與免疫共沉淀試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 以NDRV-TH11基因組cDNA為模板，進(jìn)行σ C基因擴(kuò)增。上游引物F：5'-CGGAATTCATGGATCGC AACGAGGTGATAC GCC-3'，下游引物R：5'-CCGCTCGAGCTAGCCC GTGGCGACGGTGAAGCGTAA-3'。將獲得的基因片段插入pCMV-HA載體中，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定陽性質(zhì)粒，命名為pCMV-HA-σC。

1.2.2 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（indirect immunoinfluscent assay，IFA） 將DEFs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。等細(xì)胞密度大于90%時，以Lipofectamine 2000將構(gòu)建的pCMV-HA-σC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEFs，轉(zhuǎn)染后36 h進(jìn)行IFA。PBS清洗3次，用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定，清洗3次后，以0.5%TritonX-100室溫通透15 min，5%脫脂乳37℃封閉2 h，加入Anti-HA抗體4℃孵育過夜后，清洗3次，加入DIPA室溫染核10 min后，清洗3次，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3 免疫共沉淀 將DEFs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度大于90%時，以Lipofectamine 2000將pCMV-HA-σC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEFs，轉(zhuǎn)染后36 h收樣。同時將pCMV-HA空載體及空細(xì)胞作為對照組。具體操作參見免疫共沉淀試劑盒說明書。

1.2.4 銀染 將免疫共沉淀的樣品加入SDS-PAGE蛋白膠分離，之后用ddH2O清洗2次，加入固定液固定10 min，用10%的乙醇和超純水各洗滌2次，加入增敏劑孵育1 min，用ddH2O沖洗2次后加入銀染增強(qiáng)液染色30 min，快速洗滌2次后加入顯影劑，顯影至條帶清晰，加入少量終止液，稍微混勻，棄去液體，再加入一定體積終止液徹底終止反應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，切取差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定。

1.2.5 質(zhì)譜分析 將切取的條帶樣品脫色完全后凍干，加入40 μL胰蛋白酶緩沖液進(jìn)行超濾管酶解（filter aided sample preparation，F(xiàn)ASP），37℃作用18 h，然后將酶解產(chǎn)物通過毛細(xì)管高效液相色譜進(jìn)行脫鹽及分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用軟件Mascot 2.1和Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 分子生物分析軟件包括DNAMAN、Oligo7等；同時采用http://www.geneontology.org、http://www.kegg.jp/等在線分析。

2 結(jié)果

2.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以NDRV-TH11總cDNA為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增得到σC目的片段，將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行純化后，連接至真核表達(dá)載體pCMVHA上，經(jīng)過菌落PCR、雙酶切鑒定以及目的序列測定，將鑒定陽性的重組真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pCMVHA-σC。

2.2 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Lipofectamine 2000將pCMV-HA-σC轉(zhuǎn)染DEFs，轉(zhuǎn)染后36 h進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，pCMV-HA-σC可在細(xì)胞表達(dá)，并主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，見圖1。

圖1 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The indirect immunoin fluscent assay results

2.3 免疫共沉淀及銀染結(jié)果pCMV-HA-σC轉(zhuǎn)染DEFs36 h后，收取細(xì)胞樣品，用Anti-HA單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀，并對共沉淀產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE及銀染，共找出7條差異條帶，見圖2。

圖2 免疫共沉淀及銀染結(jié)果Fig.2 The immunoprecipitation and silver staining infected results

2.4 質(zhì)譜分析將找出的7條差異條帶進(jìn)行脫色并凍干及酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽及分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，共鑒定出100個可以與σC進(jìn)行相互作用的蛋白。將獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Mascot軟件中的串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能（MS/MS Ions search）進(jìn)行搜索鑒定，篩選獲得了6個差異表達(dá)量均上升3倍以上與σC蛋白相互作用的宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白（表1）。

2.5 宿主細(xì)胞蛋白的生物信息學(xué)分析

2.5.1 GO（gene ontology）注釋 對質(zhì)譜篩選出的所有蛋白進(jìn)行GO注釋。GO由細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能以及生物過程三部分組成。細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析顯示：與σC蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白主要分布于細(xì)胞器、大分子復(fù)合體以及細(xì)胞膜等；分子功能顯示：與σC蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白具有結(jié)合能力和酶活性；生物過程結(jié)果顯示：與σC蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白主要參與細(xì)胞的代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)過程、生理調(diào)節(jié)過程以及免疫過程等，見圖3和表2。

表1 σC免疫共沉淀產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定獲得的潛在相互作用的蛋白質(zhì)Table 1 Potentially interacting proteins obtained by Co-IP

圖3 與σC互作的宿主細(xì)胞蛋白的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of the cellular proteins interacting with σC

2.5.2 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）代謝通路注釋 KEGG是主要的通路公共數(shù)據(jù)庫，通過差異顯著性基因來分析該蛋白主要參與的通路與代謝途徑。結(jié)果顯示，與σC蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白主要參與氨基酸的生物合成、碳代謝、新陳代謝、嘌呤代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、分子信號和互作過程等途徑，見圖4和表3。

表2 與σC互作的宿主細(xì)胞蛋白的GO功能分析Table 2 GO function analysis of the cellular proteins interacting with σC

（續(xù)上表）

3 討論

病毒的整個生命活動與宿主細(xì)胞因子密不可分，或者是直接利用宿主細(xì)胞因子進(jìn)行自身生命活動；或者是調(diào)整、破壞宿主細(xì)胞因子，使宿主不能正常行使某些功能，間接為自身的生命活動提供便利。與此同時，宿主細(xì)胞也在千方百計地識別外來非細(xì)胞因子，并及時清除。病毒能否成功感染宿主細(xì)胞，形成有效復(fù)制，取決于病毒與細(xì)胞之間的作用與反作用，研究病毒的復(fù)制過程實(shí)際上就是研究病毒與宿主細(xì)胞因子相互作用的過程。因此，深入了解DRV在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制過程，研究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用機(jī)制，有助于有效控制疫病流行。

NDRV-TH11是一種新型DRV，與以往報道的DRV相比，其宿主譜更廣、致病性更強(qiáng)[6]。病毒感染和致病過程是一個復(fù)雜的生物過程，但關(guān)于NDRV對宿主細(xì)胞的感染過程目前還不清楚。病毒無法自身完成復(fù)制，其復(fù)制必須依賴于宿主細(xì)胞系統(tǒng)完成，病毒進(jìn)入細(xì)胞后雇傭宿主蛋白為自身生命活動所用以及宿主蛋白發(fā)揮對病毒的拮抗和防御作用都依賴于病毒蛋白和宿主蛋白的相互作用。早期的研究發(fā)現(xiàn)病毒外殼蛋白σC與宿主細(xì)胞膜表面受體相互作用介導(dǎo)了病毒對細(xì)胞的吸附作用，是病毒感染的關(guān)鍵因子[10,12]，這提示可以從宿主細(xì)胞蛋白角度出發(fā)去研究病毒的感染過程，且研究病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用可以為解析病毒蛋白的功能以及病毒復(fù)制的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)[11-12]，所以找到與NDRV σC蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白對解析病毒的復(fù)制過程具有十分重要的意義。

本研究采用免疫共沉淀與質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法，以NDRVσC蛋白作為誘餌蛋白，將免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)濾液進(jìn)行銀染實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析，篩選出可能與病毒蛋白互作的宿主蛋白因子。對篩選的宿主蛋白進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果顯示與σC蛋白互作的宿主因子與蛋白質(zhì)的代謝過程密切相關(guān)，并且參與了蛋白的翻譯和復(fù)制過程，由此可以推測病毒利用了宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)來完成自身蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)一步表明σC蛋白在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。此外，分析顯示宿主蛋白主要分布于細(xì)胞器、大分子復(fù)合體以及細(xì)胞膜等，而間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pCMV-HA-σC表達(dá)產(chǎn)物σC主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，可以推測σC與宿主細(xì)胞蛋白互作的位點(diǎn)有可能在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中。但這些篩選出的蛋白是否與病毒σC蛋白確實(shí)具有相互作用，及其互作位點(diǎn)的位置還需要后續(xù)的免疫共沉淀、激光共聚焦、pull-down等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4 與σC互作的宿主細(xì)胞蛋白的KEGG代謝通路注釋Fig.4 KEGG pathway annotation of the cellular proteins interacting with σC

表3 與σC互作的宿主細(xì)胞蛋白的KEGG代謝通路注釋信息Table 3 KEGG pathway annotation of the cellular proteins interacting with σC

（續(xù)上表）