陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂串聯(lián)純化海藻甜菜堿的工藝研究

李辰，吳家強(qiáng)，徐學(xué)濤，梁健欣，梁春嬋

（1.五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門(mén) 529020；2.廣東杰士農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 江門(mén) 529000）

我國(guó)海藻資源豐富，利用海藻資源開(kāi)發(fā)的海藻肥是一種生態(tài)、環(huán)保、高效的新型生物肥，具有廣闊的應(yīng)用前景[1].甜菜堿是海藻的主要功能成分之一，具有保護(hù)肝臟、降血脂、抗氧化、提高免疫力等作用[2-4]，可作為制藥工業(yè)的原料.甜菜堿的季胺鹽結(jié)構(gòu)使其具有抗高鹽和抗干旱的能力，可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中的主要活性物質(zhì)之一[5-7]，也是評(píng)價(jià)海藻肥品質(zhì)的關(guān)鍵成分[8].甜菜堿還具有保濕功能，它在水溶液中極易形成氫鍵，其特性粘度和表觀比重遠(yuǎn)高于甘油，可用作保濕護(hù)膚品.此外，甜菜堿本身所攜帶的氨基和羧基使其成為一種兩性離子表面活性劑.甜菜堿的分析方法主要有比色法[5]、非水滴定法、重量法等，大型儀器分析方法主要有薄層掃描法、高效液相色譜法[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]等，但大型儀器檢測(cè)方法價(jià)格昂貴，且樣品前處理繁瑣、分析流程較長(zhǎng)、對(duì)操作技能要求高，本文采用紫外法檢測(cè)甜菜堿含量.目前，以陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂聯(lián)用提高海藻提取物中甜菜堿純度的方法鮮見(jiàn)報(bào)道.本文以我國(guó)南海海域馬尾藻為研究對(duì)象，初步考察了海藻中甜菜堿的提取分離純化工藝，以期提高海藻的資源利用率.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；BSA224S-CW電子分析天平（賽多利斯）；QE-50粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；SHA-L恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；ZNCL-BS磁力攪拌器（杭州瑞佳精密儀器公司）；TD5A-WS離心機(jī)（湖南湘儀）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）.

1.2 試劑與材料

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)ZBW110894）；雷氏鹽（四硫氰基二氨合鉻酸氨，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醚、丙酮、氫氧化鈉和鹽酸均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；氯化鈉，分析純，天津百世化工有限公司；氨水，分析純，汕頭西隴科學(xué)股份有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，廣州金華大化學(xué)試劑有限公司.

海藻原料2016年采自中國(guó)南海，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)譚志遠(yuǎn)教授鑒定為馬尾藻屬（Scagassum），樣本存放于廣東杰士農(nóng)業(yè)科技有限公司樣品室.由于海藻表面附著有鹽等雜質(zhì)，故需先充分洗滌除去鹽分及泥沙，再置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩后密封保存?zhèn)溆茫籇101和AB-8大孔吸附樹(shù)脂（鄭州勤實(shí)科技有限公司）；732和717離子交換樹(shù)脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 甜菜堿的測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行甜菜堿含量檢測(cè).

2.2 溶液配制

1）甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液a（約1.00 mg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)量0.1000 g甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品，溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定容，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液b（10.00 mg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)量甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g，用適量去離子水溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即為10.00 mg/mL的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于樹(shù)脂吸附和解吸附實(shí)驗(yàn).

2）雷氏鹽飽和液（15.00 mg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)量1.5000 g雷氏鹽，加入適量蒸餾水，用攪拌器攪拌溶解45 min，過(guò)濾后用濃鹽酸酸化到pH值為1.0（雷納克酸季胺化合物在pH=1.0時(shí)，沉淀最完全），蒸餾水定容至100 mL容量瓶，用于沉淀季胺化合物，此試劑須現(xiàn)用現(xiàn)配.

2.3 甜菜堿的分離純化

1）樹(shù)脂預(yù)處理 分別選用732陽(yáng)離子樹(shù)脂和717陰離子樹(shù)脂，以及大孔吸附型樹(shù)脂AB-8和D101進(jìn)行海藻甜菜堿的分離純化.按常規(guī)方法將陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂先后用酸堿處理后，以蒸餾水洗至中性，待用.酸堿的用量均為加入樹(shù)脂體積的2倍.大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h后，用乙醇洗至加入3倍量的蒸餾水無(wú)混濁，再用蒸餾水洗至無(wú)醇味即可，待用.

2）靜態(tài)吸附、解吸附實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取上述4種預(yù)處理好的樹(shù)脂各2.50 g，分別置入100 mL具塞三角瓶中，精確量取10.02 mg/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液b各10.00 mL，在30℃搖床振蕩吸附3 h，待吸附達(dá)平衡后，測(cè)定各溶液中甜菜堿的濃度C（emg/mL）.濾除甜菜堿吸附殘液，以適量蒸餾水清洗樹(shù)脂后，向各樹(shù)脂中加入5%氨水溶液各10.00 mL，振蕩解吸附3 h，待解吸附平衡后，測(cè)定氨水解吸液中甜菜堿的含量C（dmg/mL）.樹(shù)脂的單位吸附量Q（mg）、吸附率E（%）及解吸附率D（%）計(jì)算如下：

式中，C0為甜菜堿的初始濃度（mg/mL）；Ce為甜菜堿的平衡濃度（mg/mL）；Vi為加入的甜菜堿溶液的體積（mL）；W為樹(shù)脂的質(zhì)量（g）；Cd為解吸液中甜菜堿濃度（mg/mL）.

在篩選出適宜的732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂后，繼續(xù)考察吸附液的pH值（3.0，5.0，7.0，9.0，11.0），以及解吸液氨水的濃度（1%、3%、5%、7%、9%）對(duì)吸附和解吸附的影響.

3）動(dòng)態(tài)吸附、解吸附曲線 稱(chēng)取已預(yù)處理好的732樹(shù)脂2.00 g于玻璃層析柱（?10×300 mm）中，加入10.02 mg/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液b 20.00 mL，以2 BV/h（BV為樹(shù)脂床體積）的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液.測(cè)定不同流出液中甜菜堿的濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線.待吸附飽和后，將5%的氨水溶液按2 BV/h流速通過(guò)已吸附飽和的732樹(shù)脂，測(cè)定不同解吸液中甜菜堿的濃度，繪制動(dòng)態(tài)解吸附曲線.

4）陰陽(yáng)離子柱串聯(lián)吸附 鑒于甜菜堿在酸性條件下為陽(yáng)離子型化合物，可考慮用717樹(shù)脂吸附甜菜堿提取液中的陰離子雜質(zhì)，以進(jìn)一步純化提取物中甜菜堿的含量.海藻樣品經(jīng)水提取濃縮后，加入適量乙醇調(diào)至80%乙醇溶液，靜置10 h，將醇沉濾液的pH值調(diào)至3.0，分3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：第1組僅過(guò)732陽(yáng)離子樹(shù)脂作為參照組；第2組先過(guò)732陽(yáng)離子樹(shù)脂再過(guò)717陰離子樹(shù)脂；第3組先過(guò)717陰離子樹(shù)脂再過(guò)732陽(yáng)離子樹(shù)脂，以考察不同串聯(lián)吸附方式對(duì)純化甜菜堿的影響.上述3組樹(shù)脂柱吸附飽和后，均以5%氨水洗脫得洗脫液，收集流出的洗脫液，每5 mL接一份，根據(jù)動(dòng)態(tài)解吸附曲線檢測(cè)結(jié)果合并不同洗脫液中甜菜堿含量高的部分（即前20 mL），經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干，濃縮液轉(zhuǎn)移至表面皿干燥至恒重，稱(chēng)重并按2.1方法檢測(cè)其甜菜堿含量，比較不同串聯(lián)方式的影響.

3 結(jié)果與討論

3.1 甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.2方法配制的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液a濃度為1.050 mg/mL，準(zhǔn)確量取該溶液1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，依次分別加入蒸餾水2.50 mL、2.00 mL、1.50 mL、1.00 mL、0.50 mL、0 mL，得到甜菜堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度范圍0.300～1.050 mg/mL），再加入雷氏鹽經(jīng)冷凍沉淀、離心、萃取后在525 nm下測(cè)量吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）、甜菜堿濃度為橫坐標(biāo)（X,mg/mL） 進(jìn)行線性回歸，得其線性方程：Y=0.2542X-0.0038，線性相關(guān)系數(shù)R為0.997.

3.2 甜菜堿分離純化結(jié)果

3.2.1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸附篩選結(jié)果

按2.3方法測(cè)定4種樹(shù)脂對(duì)甜菜堿粗提取液的靜態(tài)吸附、解吸附效果，結(jié)果列于表1.可看出：732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附和解吸附效果均較好，樹(shù)脂單位吸附量為36.79 mg，吸附率為91.47%，解吸附率為75.20%；717陰離子樹(shù)脂的吸附和解吸附效果次之；其他兩種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)甜菜堿的吸附率均小于50%，解吸附率小于38%.故以吸附和解吸附性能較好的732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).這主要與甜菜堿結(jié)構(gòu)中的氮原子更易帶正電荷有關(guān)，該結(jié)論可由甜菜堿質(zhì)譜正離子掃描模式得到驗(yàn)證[11-12].

表1 4種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解吸附結(jié)果

3.2.2 吸附液pH值對(duì)732樹(shù)脂吸附性能的影響

不同pH值的吸附液對(duì)732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附甜菜堿的影響如圖1所示.由圖1可見(jiàn)：1）在中性和酸性條件下，732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)甜菜堿的吸附率在90%以上，單位吸附量也相應(yīng)較高；2）吸附液酸性越高，732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附效果越好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇吸附液pH=3.0，此時(shí)吸附率可達(dá)95%；3）732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附效果隨pH值的升高而降低，這可能緣于甜菜堿在酸性條件下分子呈開(kāi)環(huán)狀態(tài)，其陽(yáng)離子狀態(tài)利于交換吸附，而在堿性條件下，甜菜堿本身的電離受抑制，分子呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甜菜堿與732樹(shù)脂間的離子交換受影響，吸附率降低.

3.2.3 解吸液氨水濃度對(duì)732樹(shù)脂甜菜堿解吸附率的影響

以氨水作解吸劑，不同的氨水濃度對(duì)甜菜堿的解吸附結(jié)果見(jiàn)圖2：1）低濃度的氨水即可得到較好的洗脫效果，說(shuō)明堿性條件下甜菜堿容易成環(huán)利于洗脫；2）隨氨水濃度的增大解吸附率也增大，當(dāng)氨水濃度超過(guò)5%時(shí)，解吸附率的增長(zhǎng)幅度開(kāi)始減小.由于堿性較強(qiáng)不利于后續(xù)處理，故動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)采用5%的氨水溶液.

圖1 吸附液pH值對(duì)732樹(shù)脂吸附甜菜堿性能的影響

3.2.4 動(dòng)態(tài)吸附和解吸附曲線

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液b（10.02 mg/mL）流出液體積與吸附殘液中甜菜堿濃度關(guān)系如圖3-a所示：該濃度吸附液處理15 mL甜菜堿溶液時(shí)，基本不發(fā)生泄漏；繼續(xù)上柱吸附液到20 mL后，甜菜堿開(kāi)始泄露，且穿透變化迅速；吸附液達(dá)30 mL后完全穿透，不再吸附；繼續(xù)上柱吸附液會(huì)導(dǎo)致原吸附在732樹(shù)脂上的甜菜堿有少量洗脫損失.以5%的氨水溶液洗脫上述吸附飽和的732樹(shù)脂，流出液體積與洗脫液中甜菜堿的濃度關(guān)系如圖3-b所示：洗脫液到20 mL時(shí)甜菜堿已基本洗脫完全，解吸率達(dá)99%，即具有較好的解吸附效果.

圖2 氨水濃度對(duì)732樹(shù)脂甜菜堿解吸附率的影響

圖3 甜菜堿動(dòng)態(tài)吸附和解吸附曲線

3.3 陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)方式對(duì)吸附解吸附效果的影響

分別采用單一陽(yáng)離子樹(shù)脂和陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)的方式來(lái)研究實(shí)驗(yàn)海藻樣品的吸附和解吸附性能，比較其對(duì)甜菜堿的分離效果.經(jīng)樹(shù)脂分離純化后的海藻提取物樣品的質(zhì)量與甜菜堿的含量列于表2.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：1）僅過(guò)陽(yáng)離子柱的最終產(chǎn)物是淡黃色的固體，而過(guò)陰陽(yáng)兩種離子交換樹(shù)脂的流出液，無(wú)論兩種樹(shù)脂的吸附順序如何，經(jīng)濃縮后均得到白色固體，說(shuō)明提取物中的有色雜質(zhì)可能為陰離子，且可被717樹(shù)脂吸附去除；2）不同串聯(lián)方式下，最終純化提取物中甜菜堿的含量差別較大，其中717+732效果最好，其浸膏中的甜菜堿含量可達(dá)7.95%，這可能是由于吸附液中的雜質(zhì)首先被陰離子樹(shù)脂吸附后，樣品基質(zhì)變得更為簡(jiǎn)單，干擾離子占據(jù)樹(shù)脂吸附位點(diǎn)的幾率大幅下降，具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究.

表2 樹(shù)脂串聯(lián)方式對(duì)甜菜堿吸附和解吸附效果的影響

4 結(jié)論

本文考察了4種樹(shù)脂對(duì)甜菜堿的吸附、解吸附效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)離子交換樹(shù)脂比大孔吸附樹(shù)脂更適于甜菜堿的分離純化；732陽(yáng)離子樹(shù)脂對(duì)甜菜堿的吸附能力較佳，其在pH=3.0的酸性條件下吸附率較高，單位吸附量為38 mg，5%的氨水對(duì)該樹(shù)脂的解吸附效果較好；陰、陽(yáng)兩種離子交換樹(shù)脂柱串聯(lián)純化的效果明顯優(yōu)于僅過(guò)陽(yáng)離子樹(shù)脂，且先過(guò)陰離子樹(shù)脂除雜再用陽(yáng)離子樹(shù)脂的吸附、解吸附的串聯(lián)吸附法效果最佳.本文方法有望用于批量甜菜堿類(lèi)似物的分離與純化，也適用于天然產(chǎn)物中在特定條件下呈離子型的化合物.