蛹蟲草主要成分蟲草素、腺苷提取方法對比

馬麥艷　張相鋒　焦子偉

摘要利用前期加速溶劑萃取法提取腺苷、蟲草素的優(yōu)化結(jié)果，分別挑選最優(yōu)處理進行試驗，即提取腺苷最適條件為溫度70C、時間10min、乙醇含量20%、循環(huán)2次，提取蟲草素最適條件為溫度1009C、時間15min、乙醇含量0%.循環(huán)2次。并將該方法與水熱回流法、醇熱回流法、超聲水提法、超聲醇提法4種傳統(tǒng)方法進行比較，結(jié)果表明，加速溶劑萃取法明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)4種方法，各個方法之間差異達顯著水平（P<0.05）;加速溶劑蓽取法提取腺苷效果最好，提取量為2118.07μg/g，提取效果最差的是超聲波醇提法，提取量僅有180.72μg/g;加速溶劑萃取法提取的蟲草素量為19678.70μg/g，超聲波醇提法提取蟲草素效果最差，提取量僅有4108.27μg/g;加速溶劑萃取法有其明顯的優(yōu)勢，操作簡單、方便快捷。

關鍵詞 蛹蟲草;加速溶劑萃取法;蟲草素;腺苷;成分提取

中圖分類號 TS264.3

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0220-03

蟲草素（Cordycepin），全稱3一脫氧腺苷，分子式為C.gH3N，O3，是核苷類的一種，pH值偏堿性，常溫下是固態(tài)晶體，性狀為片狀或針狀，其熔點為230～231C"，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿等有機溶劑，紫外光最大吸收波長為259nm！2。腺苷也是核苷類的一種，具有抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、改善心腦血液循環(huán)等作用34。一般提取蟲草素的方法都能一并獲得腺苷，已報道的傳統(tǒng)提取方法有浸提法、超聲法、索氏提取法、回流法、滲漉提取法等15日。鐘艷梅等叫以人工蛹蟲草固定培養(yǎng)殘基為原料，采用索式提取法提取蟲草素，結(jié)果表明，水比乙醇更利于提取蟲草素。王英娟等8也采用超聲法、回流法與提取溶劑水.乙醇組合的4種提取方法獲得蟲草素，結(jié)果表明，水熱回流法效果最佳。譚琪明等后續(xù)采用傳統(tǒng)的高溫水浴提取技術獲得蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中的蟲草素，提取率為94.87%，進一步說明了水提取蟲草素的優(yōu)勢，超聲波提取法也是一種傳統(tǒng)方法，張嘉等叫通過比較不同方法得出超聲波提取法的提取效果最好?？焖偃軇┹腿x（Accelerated?Solvent?Extraction，ASE）1-19，是利用溶劑對固體、半固體的樣品進行萃取16，近幾年，在國內(nèi)外均有利用ASE提取天然活性成分的研究，但利用加速溶劑萃取法提取蛹蟲草中蟲草素及腺苷尚未見報道。目前，蟲草素分離純化是研究的一個熱點領域，本文利用前期對加速溶劑萃取法提取蟲草素、腺苷優(yōu)化結(jié)果，在此基礎上，分別挑選提取腺苷和蟲草素最好的處理，與水熱回流法醇熱回流法、超聲水提法、超聲醇提法4種傳統(tǒng)方法進行比較，確定最佳的提取工藝方法。通過用HPLC測定蟲草素含量來比較各個方法的優(yōu)劣，以期為伊犁乃至新疆地區(qū)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的提取提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株。蛹蟲草為本實驗室人工培育，蟲草素及腺苷標準品購自北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.1.2供試試劑。乙醇（C2HsoH），分析純，購自德州潤昕實驗儀器有限公司;乙腈（C2H3N），色譜純，購自德州潤昕實驗儀器有限公司;超純水。

1.2試驗方法

1.2.1蟲草素腺苷標準品的配制。參考陳方圓等叫的方法，腺苷、蟲草素標準品各取10mg（按實際含量折算），用流動相（乙腈：水為5：95）定容至100mL，搖勻。

1.2.2標準曲線繪制。參考陳方圓等四的方法進行標準曲線繪制。

1.3試驗設計

1.3.1蛹蟲草粉前處理。將若千曬干的蛹蟲草子實體放入粉碎機中粉碎約1min，粉碎的蛹蟲草子實體粉末過60目篩子，將樣品混勻后用電子分析天平稱取3份（每份5g）用于后續(xù)加速溶劑萃取法萃取腺苷、蟲草素;分別稱取12份（每份4g）用于后續(xù)水熱回流法、醇熱回流法、超聲波水提法超聲波醇提法提取腺苷和蟲草素。

1.3.2加速溶劑萃取法。前期對加速溶劑萃取法提取蟲草素腺苷條件進行了優(yōu)化，本試驗在此基礎上分別挑選最好的處理與4種傳統(tǒng)方法進行比較，即提取蟲草素最適處理為溫度100C時間15min、乙醇含量0%、循環(huán)2次，提取腺苷最適條件為溫度70C時間10min，乙醇含量20%、循環(huán)2次。

1.3.3傳統(tǒng)方法。一是水熱回流法。將稱取的蛹蟲草粉用雙蒸水定容至100mL，于100C熱回流2h放冷后4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。二是醇熱回流法。將稱取的蛹蟲草粉用50%乙醇定容至100mL，于80C熱回流2h放冷后4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液24-251。三是超聲波水提法。將稱取的蛹蟲草粉用80mL蒸餾水溶解，然后于25C、100Hz超聲波清洗器中超聲3h，定容至100mL，4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。四是超聲波醇提法。將稱取的蛹蟲草粉用乙醇與水的混合液（1：1）80mL溶解，然后于25C、100Hz超聲波清洗器中超聲3h，定容至100mL，4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。

1.4高效液相色譜（HPLC）

檢測條件：色譜柱C18（4.6mmx250mm，5μm）;流動相乙腈：水=5：95;流速為1.0mL/min;柱溫為35C;進樣量為10μL，在波長260nm紫外檢測器檢測。將不同梯度的蟲草素和腺苷標準品溶液，通過標樣峰面積制成標準曲線。將被測提取液分別進行高效液相色譜檢測，依據(jù)標準曲線計算各處理樣品蟲草素和腺苷含量。相關公式參考陳方圓等的方法。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究數(shù)據(jù)以平均值為計算值，數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件（Version11.5，USA）、EXCEL軟件進行數(shù)據(jù)處理與方差分析（ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線計算

稱取腺苷、蟲草素標準品，分別配成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的溶液，各取10μL進樣分析。依據(jù)標準曲線確定線性范圍，得出蟲草素線性回歸方程為Y=32.241X-1.2731，相關系數(shù)R=0.9999;腺苷線性回歸方程為Y=33.443X-9.0664，相關系數(shù)R=0.9993。

2.2HPLC色譜圖

標準品與樣品測定結(jié)果如圖1所示。圖中峰A為腺苷色譜峰，峰B為蟲草素色譜峰。圖1（a）為50μg/mL蟲草素、腺苷標準品混合液的色譜圖，從中可以看出，色譜圖中蟲草素腺苷實現(xiàn)了基線分離，而且出峰時間也控制得比較好，出峰時間為A=7.281min、B=9.943min，該流動相條件可以用來定量檢測蟲草素、腺苷的含量。圖1（b）～（f）為5組不同方法的色譜圖，不同處理蟲草素、腺苷出峰時間與標準品相似，加速溶劑萃取法出峰時間A=7.204min、B=10.098min，水熱回流法出峰時間A=7.284min、B=10.008min，醇熱回流法出峰時間A=7.288min、B=10.077min，超聲波水出峰時間A=7.287min、B=9.958min，超聲波醇提法出峰時間A=7.271min、B=10.158min，說明該儀器運行穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準確。

2.3腺苷含量

由表1可知，用5種不同方法提取腺苷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種方法之間提取的腺苷含量差異達顯著水平（P<0.05，下同）。其中，加速溶劑萃取法提取效果最好，提取腺苷量為2118.07μg/g;超聲波水提法次之，提取量為1702.40μg/g;腺苷提取效果最差的是超聲波醇提法，提取量僅有180.72μgg。

2.4蟲草素含量

用5種不同方法提取蟲草素，發(fā)現(xiàn)不同方法之間差異均達到顯著水平，，其中，提取蟲草素效果最好的是加速溶劑萃取法，該方法提取蟲草素的量為19678.70μg/g;超聲波水提法次之，蟲草素提取量為10217.45μg/g;其次是水熱回流法，蟲草素提取量為6018.21μg/g;醇熱回流法次之，提取量為5293.10μg/g;超聲醇提法提取蟲草素效果最差，提取量僅有4108.27μg/g。

3結(jié)論與討論

超聲波水提法、超聲波醇提法、水熱回流法和醇熱回流法是提取腺苷、蟲草素的常用方法，已有不少學者做過相關試驗，由于原料不同、條件差異等方面的因素，導致得到的結(jié)果也有差異。吳勇等問采用上述方法和滲漉法、微波法共6種方法來提取蟲草素，通過試驗以提取量的多少將這幾種方法進行排序：滲漉法>微波法>水熱回流法>醇熱回流法>超聲波水法>超聲波醇法。隨后韓建華等29也做了相關試驗，采用超聲波水提法、超聲波醇提法水熱回流法和醇熱回流法提取腺苷和蟲草素，結(jié)果表明，超聲波水提法是最優(yōu)方法，本組試驗目的和韓建華等的相同，即比較5種不同提取方法提取腺苷、蟲草素的效果。

加速溶劑速萃取法是近些年新出現(xiàn)的一種新型提取方法，其原理和CO2超臨界萃取儀相似，該方法具有操作流程簡單、全自動、溶劑用量少、時間短、材料前后期處理簡便等優(yōu)點叫。目前，不少學者利用加速溶劑萃取法得到了生物堿、苷類等物質(zhì)。趙恒強等171用此法從黃連中提取黃連素（鹽酸小檗堿）并用正交試驗對試驗條件優(yōu)化，確定該方法適合提取黃連內(nèi)的生物堿，最佳提取條件是溫度130C、80%C2H，0H+0.5%HCI作提取溶劑、靜態(tài)提取10min.提取1次;石矛等18得到人參總皂苷，確定最佳工藝參數(shù)為提取溫度140C、提取時間5min、循環(huán)次數(shù)3次。但目前用此方法提取腺苷、蟲草素的研究很少。前期筆者對加速溶劑萃取法提取腺苷、蟲草素條件進行了優(yōu)化，本試驗在此基礎上分別挑選提取腺苷、蟲草素效果最好的處理與其他4種傳統(tǒng)方法進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該技術與傳統(tǒng)提取腺苷、蟲草素方法相比具有明顯優(yōu)勢，它是利用高壓、高溫條件，快速從蛹蟲草中提取出腺苷、蟲草素，并且提高了蟲草素在溶劑中的溶解度和溶出速率。加速溶劑萃取腺苷、蟲草素的研究，為提取腺苷、蟲草素增加了選擇方法。

試驗結(jié)果表明，加速溶劑萃取法明顯要優(yōu)于其他傳統(tǒng)4種方法，該方法提取的蟲草素量為19678.70μg/g，超聲波醇提法提取蟲草素效果最差，提取量僅有4108.27μg/g。加速溶劑萃取法具有明顯的優(yōu)勢，操作者只需將所有樣品放人儀器一般等待5～20min即可完成萃取。在后期檢測時也只需定容、過膜就可直接上HPLC檢測蟲草素、腺苷的含量綜上所述，加速溶劑萃取法用于提取蛹蟲草中蟲草素及腺苷更為方便快捷。本試驗為伊犁乃至新疆地區(qū)蛹蟲草主要活注物質(zhì)提取提供了一定的技術參考依據(jù)。

4參考文獻

[1]徐廷萬，王麗波段文健，等人工蛹蟲草胞外多糖對受抑制的免疫功

能的影響及抗疲勞作用[J].中藥藥理與臨床，2002，18（6）：17-18.

[2]陳毓荃生物化學實驗方法和技術[M].北京：科學出版社，2003：102-106.

[3] PELLEG A， PORTER R S.The pharmacology of adenosine[J].Pharmacot-?herapy ：The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy， 1990， 10（3）：157-174.

[4] KITAKAZE M， HORI M.Adenosine therapy ：a new approach to chronic?heart failure[J].Expert Opinon on Investigational Drugs ， 2009 ，9（11）：2519- -2535.

[5]黃子琪，賁松彬，桑育黎，等微波法與超聲破碎法提取蛹蟲草菌絲體中蟲草素的比較研究[J].食品科學，2009，30（18）：176-180.

[6]吳勇，陳衛(wèi)東，王利，等.蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草素的幾種提取方法比較|[J].安徽藥業(yè)，2010，14（3）：284-285.

[7]鐘艷梅，黃志全，溫凱.人工蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取分離研究[J]現(xiàn)代食品科技，2007，23（2）：40-42.

[8]王英娟，李多偉，王義潮，等.蛹蟲草中蟲草素蟲草多糖綜合提取工藝研究[J].西北植物學報，2005，25（9）：1863-1867.

[9]譚琪明，何珺，文庭池，等蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中蟲草素提取工藝的研究小山地農(nóng)業(yè)生物學報，2011，30（4）：357-361.

[10]張嘉，李多偉，任靜.正交試驗提取蟲草素的工藝研究[J].中國新醫(yī)藥，2004，3（2）：34-35.

[11] RICHTER B E，JONES B A， PORTER L N， et al.Accelerated solvent?extraction： A technique for sample preparation[J].Analytical and Bioan-alytical Chemistry， 1996 ， 68（6）： 1033.

[12]王淑紅，熊英，王祥紅.加速溶劑萃取法用于燈盞細辛中燈盞乙素的測定[J].藥物分析雜志，2006，26（5）：703.

[13]陳艦，張景華.快速溶劑萃取一高效液相法測定茶葉中多菌靈殘留量小.廣東化工，2011，38（1）：170.

[14]劉斌.加壓溶劑提取一HPLC法同時測定老鷹茶中7個黃酮類化合物[J].藥物分析雜志，2010，30（8）：1424.

[15] WONG LJ ，CURTIS L W.R.ecent advances in extraction of neutraceuti-cals from plants[J].Trends in Food Science & Technology ，2006， 17（6）：300.

[16]劉志，阮長春，劉天志，等.HPLC法同時測定林下參、鮮人參.生曬

參和紅參中14種人參皂苷[J].中草藥，2012，43（12）：2431-2434.

[17]喻凌寒，宋之光，陳江韓，等.快速溶劑萃取反向高效液相色譜法測定青蒿中的青蒿素[J].分析實驗室，2006（8）：68-71.

[18]劉平懷，劉洋洋，時杰，等加速溶劑萃?。ˋSE）技術提取海南蘿芙木活性成分[J].精細化工，2009，26（11）：1120-1123.

[19] PAPAEFSTATHIOU G， POLYCHRONOPOULOS P，ALIGIANNIS N，et?al.Comparaive study of accelerated solvent extraction and supercriticalfluid extraction of total phenolics and flavonoids from Sideritis faeserisubsp attica and atudy pf antioxidant activity[J].Panta Medica， 2008 ，74（9）：1122.

[20]宋文斌，代英成，許敏，等.加速溶劑萃取一液相色譜紫外檢測法測

定人參中多種人參皂甙含量[]現(xiàn)代科學儀器，2009（6）：104-108.

[21] ARAPITSAS P， SJOBERG P J R ，TURNER C.Characterisation of anth - -ocyanins in red cabbage using high resolution liquid chromatographycoupled with photodeode array detection and electrospray ionization-liner ion trap mass spectrometry[J].Food Chemistry，2008， 109：219-226.

[22] MURAT GIZIR A，NUZHET TURKER ， ERDEM ARTUVAN.Pressur-?ized acidifide water extraction of black carrot （ Daucus carota ssp.saticuscar.atrorubens Alef. ）anthocyanins[J].European Food Research and Te-chnology ， 2008 ， 226：363-370.

[23]陳方圓，馬麥燕，張相鋒，等加速溶劑萃取法提取蛹蟲草主要成分工藝優(yōu)化分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2018，55（5）：928-935.

[24]韓建華，楊淑芳，孫繼紅，等.蛹蟲草中蟲草素、腺苷綜合提取工藝研究[J].北方蠶業(yè)，2011，32（4）：24-27.

[25]申進文，孫曉萍，趙旭，等.人工蛹蟲草核苷類成分超聲提取工藝優(yōu)

化及HPLC定量分析[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，45（4）：391-394.

[26] CONNOLLY G P，DULEY J A.Uridine and its nucleotides ： biological?actions ， therapeutic potentials[J].Trends in Pharmacological Sciences，1999，20（5）：218-225.

[27]趙恒強，陳軍輝，郭秀春，等加速溶劑萃取法快速提取黃連中的生物堿[J].分析試驗室，2008，27（11）：5-9.

[28]石矛，陳麗娜.快速溶劑萃取儀提取保健食品中人參皂苷條件優(yōu)化[J]：食品安全質(zhì)量檢測學報，2016，7（1）：39-43.