山茶花花粉中稀土與重金屬元素含量及花粉多糖的提取與生物活性研究

張 朵，閆榮玲*，羅志威，黃湘豫，閆江濤，廖 陽*

1湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用省重點實驗室，永州 425199；2秦皇島市骨科醫(yī)院，秦皇島 066000

山茶花(Camelliajaponica)為山茶科山茶屬植物，其花粉已被證明具有抗癌、抗氧化、抗衰老等多種生理功效，日常生活中常用作保健品[1-2]，食用花粉作為保健品時，在攝入所含多糖等活性物質(zhì)的同時也攝入了不利于健康的稀土元素(rare earth elements，REE)與重金屬元素(heavy metal element，HME)，在人體富集會導(dǎo)致代謝異常、神經(jīng)傳導(dǎo)受阻、機(jī)能亢進(jìn)、組織損傷與病變等毒害效應(yīng)[3-6]。因此，測定REE與HME在山茶花粉中的含量，評估其是否在對人體不會產(chǎn)生毒害效應(yīng)的安全水平十分必要。植物花粉多糖具有增強免疫力、調(diào)節(jié)血糖血脂、抑菌抗病毒等生理功效，并已成為近年來研究的熱點[1]，但目前還鮮見山茶花粉多糖提取及生物活性的相關(guān)研究報道[4]。提取得到花粉多糖是進(jìn)行其生物活性測試的前提，而植物花粉的堅韌細(xì)胞壁會阻礙胞內(nèi)活性物質(zhì)的釋出，導(dǎo)致傳統(tǒng)的提取工藝往往次數(shù)多、耗時長、效率低[5,6]。因此消除花粉壁的傳質(zhì)阻力對提高花粉多糖提取得率十分關(guān)鍵。纖維素酶可通過水解細(xì)胞壁的主要成分纖維素使細(xì)胞壁變得疏松甚至破裂崩解；微波則兼具穿透力強和細(xì)胞破碎效果[8]?？梢姀睦碚撋现v，纖維素酶與微波協(xié)同可在山茶花粉多糖提取中起到積極的輔助作用而提高提取效率和得率，當(dāng)然這有待實驗的證明?；诖耍狙芯繙y定了山茶花粉的所有種類REE及花粉中常見的部分HME含量，摸索建立了山茶花花粉多糖的纖維素酶-微波協(xié)同提取工藝，并分析了提取所得花粉多糖在增強機(jī)體免疫力與抗疲勞方面的生物學(xué)活性，以期為人們后續(xù)更好開發(fā)利用山茶花粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

山茶花采自湖南科技學(xué)院校園(經(jīng)化學(xué)與生物工程學(xué)院黃國文博士鑒定為山茶科山茶屬山茶花)，所采花朵花瓣無病蟲害侵害跡象，且花瓣完整、鮮艷。采集的花朵及時帶回實驗室，剝離花瓣后平鋪于培養(yǎng)皿烘箱中60 ℃烘干至恒重，過篩去除花絲等雜質(zhì)并粉碎備用。

1.2 實驗動物

50只清潔級3周齡昆明小鼠，雌雄各半，體重12.0～12.8 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK(湘)2016-0002。

1.3 試劑與儀器

重金屬元素標(biāo)準(zhǔn)液(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)、稀土元素標(biāo)準(zhǔn)液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、硝酸(超級純，蘇州晶瑞化學(xué)有限公司)、纖維素酶(15 U/mg，上海博奧生物科技有限公司)、石油醚、濃硫酸、乙醇苯酚、氯仿、正丁醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

Agilent 7700電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)，JP-300B高速多功能粉碎機(jī)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，UV-2800紫外光柵分光光度計，JY92-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀，XH-MC-1微波合成儀，AB304-S型分析電子天平；RF52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；低溫高速離心機(jī)；YSI-1500乳酸分析儀。

1.4 重金屬與稀土元素含量測定

采用密閉高壓消解ICP-MS法進(jìn)行重金屬與稀土元素含量測定[12]。ICP-MS工作參數(shù)為功率：1 250 W；冷卻氣流速：15 L/min；輔助氣流速：1.0 L/min；載氣流速：1.10 L/min；采樣深度：8.0 mm；分析模式：全定量。取適量重金屬或稀土元素混合標(biāo)準(zhǔn)液，用5%稀硝酸稀釋各稀土元素標(biāo)準(zhǔn)液配制成濃度為0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列，然后將標(biāo)準(zhǔn)液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，測定相應(yīng)的信號響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取花粉0.500 0 g置消解內(nèi)罐中，加入5.0 mL濃硝酸浸泡過夜。蓋好內(nèi)蓋后旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱，160 ℃保持6 h，在箱內(nèi)自然冷卻至室溫，緩慢旋松不銹鋼外套，將消解內(nèi)罐取出，放在控溫電熱板上于140 ℃趕酸，當(dāng)內(nèi)罐消化液約剩2.0 mL時加5.0 mL超純水繼續(xù)趕酸至2.0 mL左右，重復(fù)以上步驟直至趕酸完成。消解內(nèi)罐放冷后，將消化液轉(zhuǎn)移至10.0 mL容量瓶中(洗罐3次，合并洗液)定容，混勻后注入ICP-MS得到相應(yīng)信號響應(yīng)值(以不加樣本的濃硝酸為空白對照)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中相應(yīng)元素的濃度。平行測定3次，取平均值。

1.5 多糖最佳提取工藝的確定

1.5.1 多糖含量測定

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖40.20 mg置于500 mL 容量瓶中，加水至刻度后搖勻。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各自以蒸餾水補至2.0 mL。加入5%苯酚1.0 mL后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻振蕩室溫放置20 min，482 nm處測定吸光度(以2.0 mL蒸餾水同樣操為空白對照)。以葡萄糖質(zhì)量、吸光度分別為橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。準(zhǔn)確稱取提取所得樣本0.01 g，蒸餾水定容10 mL后，取其中2.0 mL按照上述步驟測得吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出所提取多糖樣品中的多糖含量(平行測定3次，計算平均值)。

1.5.2 提取流程

參考已有文獻(xiàn)[14]，結(jié)合纖維素酶自身特性及前期預(yù)實驗，確定提取過程中影響較小的3個因素，分別為料液比為1∶15、溫度50 ℃和作用pH5.0。提取流程：稱取山茶花粉末5.0 g，加入純凈水75 mL及一定量纖維素酶后于50 ℃和pH5.0條件下處理一定時間后置于微波合成儀中，在一定微波功率下處理一段時間后抽濾，所得濾液加入無水乙醇至終濃度90%，并于5 000 rpm下離心得沉淀。沉淀用蒸餾水溶解得粗多糖溶液，然后將多糖溶液與Sevag脫蛋白液按4∶1的體積比混合搖勻，離心收集上清液后再次加入無水乙醇至終濃度達(dá)90%，離心得沉淀，75%乙醇洗滌2次并真空干燥[5]。

1.5.3 單因素實驗與正交優(yōu)化

分別考察酶用量、酶解時間、微波時間、微波功率4個因素對山茶花粉總多糖得率的影響。酶用量分別設(shè)置0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15 g/g，酶解時間分別設(shè)置40、60、80、100、120、150 min，微波時間分別設(shè)置5、15、25、35、45、55 s；微波功率分別設(shè)置100、200、300、400、500、600 W等6個水平。進(jìn)行某一單因素實驗時，其他因素保持不變，取酶用量0.06 g/g、酶作用時間80 min、微波時間25 s、微波功率300 W。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取各因素3個較好水平按照L9(34)進(jìn)行正交優(yōu)化，得到最佳提取工藝。

1.6 多糖生物學(xué)活性測試

1.6.1 抗疲勞活性測試

參考已有方法并稍作改良[15]：20只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為對照組、200 mg/(kg·d)多糖處理組，每組10只(雌雄各5；后同)。各組每天自由攝食和飲水，連續(xù)灌喂20天，處理組灌喂多糖溶液，對照組灌等量生理鹽水。每次灌胃30 min后，各組小鼠分別置特定水箱中游泳2 min。每次水箱水深30 cm、水溫30 ℃及放置位置等條件保持一致。末次灌喂30 min后，將小鼠置水箱中游泳60 min，分別于游前10 min及游后0、60、120、180 min鼠尾采血，用乳酸分析儀測定小鼠血液中乳酸含量。

1.6.2 免疫器官保護(hù)活性

昆明小鼠30 只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天后隨機(jī)分為正常對照組、免疫抑制組、多糖處理組，每組10 只。分別于分組后第3、5、7天對免疫抑制組、多糖處理組所有個體進(jìn)行環(huán)磷酰胺(50 mg/kg)腹腔注射，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水；并從實驗第1天起，多糖處理組連續(xù)20天按照200 mg/(kg·d)的劑量進(jìn)行多糖溶液灌胃處理，正常對照組與模型對照組則灌以等體積生理鹽水。末次灌胃24 h后稱體重并頸椎脫臼處死后取小鼠脾臟及胸腺濾紙吸干血跡后稱重，通過臟器重(mg)與體重(g)比值計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003、SPSS 19.0進(jìn)行整理與分析；使用Sigmaplot 10.0等軟件進(jìn)行作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 山茶花花粉的重金屬與稀土元素含量

各稀土元素與重金屬元素含量見表1。山茶花粉樣本中稀土元素含量極低，所有種類的總含量為0.071 5 mg/kg；鑭含量最多為0.020 1 mg/kg，其次有鈰(Ce)、釹(Nd)、銪(Eu)，均超過了0.01 mg/kg；釔、釤、釓、鐠、鐿5種元素含量介于0.01與0.001 mg/kg之間；其余元素含量均低于0.001 mg/kg，且钷元素最少(0.000 6 mg/kg)，另有鈥、銩、镥、鈧4種元素未被檢出。被檢測的常見重金屬銅、鋅、鎘、鉛、汞、鉻的含量也極低，其中鉻(Cr)、汞(Hg)未檢出，其他幾種重金屬元素的含量均高于稀土元素含量。

表1 山茶花花粉中重金屬與稀土元素含量

2.2 山茶花花粉多糖提取最佳工藝

所考察各因素均對山茶花粉多糖得率有明顯影響。在酶用量為0.02～0.06 g/g、酶解時間40～80 min，微波時間5～35 s、微波功率200～500 W范圍內(nèi)，多糖得率隨著酶用量、酶作用時間、微波時間、微波功率的增加表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，但在酶用量0.08 g/g，酶作用時間100 min，微波時間35 s，微波功率500 W后，多糖得率維持穩(wěn)定。具體如圖1所示。

根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定各自3個較優(yōu)水平(酶用量0.06、0.08、0.10 g/g，酶作用時間80、100、120 min，微波時間25、35、45 s， 微波功率300、400、500 W)進(jìn)行正交優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所考察的4個因素對山茶花粉多糖得率的影響大小順序為：微波功率>微波時間>酶解時間>酶用量，最佳提取工藝為A2B1C3D3，即酶用量0.08 g/g，酶作用時間80 min，微波時間45 s，微波功率500 W(表2)，此條件下總多糖得率為2.69%。

圖1 各因素對山茶花花粉多糖得率的影響Fig.1 Effect of various factors on yield of polysaccharide from C.japonica pollen

2.3 山茶花多糖生物學(xué)活性

如圖2 A所示，泳前多糖處理組小鼠的血液中乳酸含量(14.12 mmol/L)弱低于對照組(14.24 mmol/L)，但無顯著性差異(P>0.05)。游泳90 min后，兩組小鼠血液中的乳酸濃度相對泳前均出現(xiàn)急劇增加，且對照組乳酸濃度高于多糖處理組；游泳結(jié)束進(jìn)入休息階段后，隨休息時間的延長，兩組小鼠的血乳酸含量均呈逐漸降低的趨勢；休息180 min后，多糖處理組乳酸濃度已完全恢復(fù)到泳前水平(14.01 mmol/L，稍低于泳前濃度)，但對照組依然高于泳前水平。通過測定泳后兩組小鼠乳酸濃度的變化率發(fā)現(xiàn)，不管是游泳剛結(jié)束時，血乳酸濃度較泳前的增加率，還是泳后不同時間節(jié)點較前一時間節(jié)點的血乳酸濃度減少率，多糖處理組均大于對照組(圖2 B)。

表2 山茶花花粉多糖纖維素酶-微波輔助提取正交優(yōu)化結(jié)果

圖2 山茶花花粉多糖對血乳酸濃度的影響Fig.2 Effect of polysaccharide from C.japonica pollen on the concentration of blood lactic acid注：A:游泳前后血乳酸濃度變化；B:泳后不同時間血乳酸相對先前變化率。Note：A:Concentration changes of blood lactate before and after swimming;B:Rate of blood lactate change was different at different time after swimming.

分析山茶花粉多糖對免疫抑制小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)處理的免疫抑制組小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)均顯著低于正常對照組(P<0.05)；而經(jīng)過花粉多糖灌胃處理的小鼠，其胸腺與脾臟指數(shù)相對環(huán)磷酰胺抑制組得到顯著提高(P<0.05)，但仍弱低于正常對照組(圖3)。

圖3 山茶花花粉多糖對免疫器官的保護(hù)作用Fig.3 Effect of polysaccharide from C.japonica pollen on the immune organ注：**代表P<0.05。Note:** indicated P<0.05.

3 討論

植物花粉由于具抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、益智造血等諸多功效而成為一種普及率高的保健品，但花粉中稀土與重金屬元素在體內(nèi)富集會導(dǎo)致智力下降、免疫異常、器官損傷等系列毒害作用[5,6]。因此測定花粉中稀土元素與重金屬元素的含量可以評估其作為保健品食用是否有損人體健康[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，被檢山茶花花粉中稀土元素含量極低，部分元素甚至未被檢出，所有17種稀土元素總含量為0.071 5 mg/kg，遠(yuǎn)低于2.0 mg/Kg的國家控制標(biāo)準(zhǔn)[18]；重金屬元素中的鉻與汞也未被檢出，其余幾種含量較稀土元素高但均未超出安全標(biāo)準(zhǔn)[19]?？梢姡讲杌ǚ壑械南⊥猎嘏c重金屬元素富集不明顯，各元素的含量處于安全范圍，食用山茶花粉作為保健品不會導(dǎo)致稀土元素與重金屬元素在體內(nèi)的大量富集而引發(fā)毒副作用。當(dāng)然，本測定結(jié)果僅限所采樣本，還需更多不同采集地山茶花粉測定數(shù)據(jù)的支持。

多糖是植物花粉中普遍含有的活性物質(zhì)，近年已從油菜、馬尾松、桂花、板栗等多種植物花粉中提取獲得多糖，以期進(jìn)行深入研究或產(chǎn)品開發(fā)[7,8,12,13]?；ǚ圩钔鈱拥募?xì)胞壁是其活性物質(zhì)提取的主要障礙，本研究借助纖維素酶與微波的協(xié)同輔助提取山茶花粉多糖，摸索建立了山茶花粉多糖的纖維素酶-微波輔助提取工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶用量0.08 g/g，酶解時間80 min，微波時間45 s，微波功率500 W條件下的提取得率可達(dá)2.69%。相對傳統(tǒng)的水提醇沉等傳統(tǒng)提取方法，經(jīng)過纖維素酶與微波二者協(xié)同輔助下的多糖得率更高、時間更短、次數(shù)更少[8-10,20]。可見，纖維素與微波有效破壞了花粉的細(xì)胞壁，提高了多糖的釋出速度與釋出量，從而獲得了更佳的提取效率與得率。

本研究對提取所得山茶花粉多糖的抗疲勞測試發(fā)現(xiàn)，多糖處理組小鼠運動結(jié)束時的血乳酸含量增加較對照組少；而進(jìn)入休息階段后，各觀測時間節(jié)點小鼠血乳酸濃度衰減率多糖處理組均優(yōu)于對照組。結(jié)果說明，山茶花粉多糖可有效減少運動中機(jī)體乳酸的產(chǎn)生量并提高運動結(jié)束后體液中乳酸的代謝速度，從而有效延緩機(jī)體疲勞進(jìn)程并加快疲勞的消除速度，表現(xiàn)出良好的抗疲勞活性，這與人們在其他植物多糖的相關(guān)研究結(jié)果一致[9,15,21,22]。免疫活性測試中則發(fā)現(xiàn)花粉多糖處理組的小鼠胸腺與脾臟指數(shù)相對免疫抑制組得到顯著提高，提示山茶花粉多糖除具有抗疲勞功效之外，還對免疫器官具有較好的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過測定山茶花粉中稀土元素以及有害重金屬元素的含量確定了其處于絕對安全水平；建立了合理、省時、高效的山茶花粉多糖的纖維素-微波輔助提取工藝；發(fā)現(xiàn)了山茶花粉多糖良好的抗疲勞與增強免疫力活性。研究結(jié)果可為山茶花的綜合利用與開發(fā)提供參考。

致謝：感謝永州市疾病預(yù)防與控制中心檢驗科唐融政主任等對本工作的支持與幫助。