金花茶異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析

王 輝，葉曉霞，朱宇林，項(xiàng)文化，周興文

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.玉林師范學(xué)院，廣西 玉林 537000；3.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

金花茶Camellia nitidissimaChi.是我國(guó)珍惜瀕危植物，也是山茶科 Theaceae山茶屬Camellia金花茶組的模式植物[1]，其花色金黃，具有很高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[2]，被譽(yù)為植物界中的“大熊貓”[3]。研究表明，金花茶花色與其花瓣中所含的類(lèi)胡蘿卜素成分具有密切關(guān)系[4]。

植物體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素成分屬于萜類(lèi)化合物，這些物質(zhì)的合成大都需要有異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl diphosphate isomerase，IPI）的參與[5]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IPI是植物體內(nèi)萜類(lèi)物質(zhì)合成中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，對(duì)植物類(lèi)胡蘿卜素的合成具有重要作用[6]。目前已經(jīng)有滇龍膽Gentiana rigescensFranch.ex Hemsl.[7]、向日葵Helianthus annus[8]、臘梅Chimonanthus praecox(L.)Link[9]、鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimuraet Migo[10]、喜樹(shù)Camptotheca acuminateDecrw.[11]、番茄Solanum lycopersicum[12]、玉米Zea mays[13]、丹參Salvia miltiorrhizaBunge[14]和冬凌草Rabdosia RubescensHenrsl.Hara[15]等植物的IPI基因被克隆，還有部分植物的IPI基因的功能已經(jīng)被闡明，但在金花茶中該基因還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用同源克隆和RACE（Rapidamplification of cDNA Ends）技術(shù)[16-17]，從金花茶花瓣中克隆了IPI基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CnIPI，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息分析，為深入研究該基因的功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和試劑

金花茶種植于玉林師范學(xué)院苗圃中，于花朵盛開(kāi)時(shí)采集金花茶花瓣，液氮處理后保存于-80 ℃冰箱，備用。

RNA提取試劑盒RN38-EASYspin Plus為天澤基因公司生產(chǎn)，反轉(zhuǎn)錄酶為Fermentas公司生產(chǎn)，感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、T4 連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取及DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，pGEM-Teasy Vector 購(gòu)自Promega公司，引物由北京鼎國(guó)生物公司合成，基因測(cè)序由華大基因深圳中心完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

從Genbank中搜索已公布物種IPI基因序列，經(jīng)比對(duì)之后尋找保守區(qū)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)同源擴(kuò)增引物。本試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的IPI基因引物為：SP（正向），5′-GGAGGCTGATGTTCGAG-3′；AP（反向），5′-CATGATCCCACCACTTGAAC-3′ （在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候應(yīng)該有可變堿基才科學(xué)）。

1.2.2CnIPI保守片段的獲得

將金花茶花瓣在液氮條件下研磨后，用試劑盒提取總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

以合成的cDNA為模板，利用2×Taq PCR MasterMix和引物對(duì)SP/ AP進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，5min；98 ℃，30 s；56 ℃，30 s；68 ℃，20 s；68 ℃，5 min；共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，將目的條帶切割后回收并檢測(cè)回收產(chǎn)物。

將回收后的片段與pGEM -Teasy載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH-5α，于含有100 mg/mL的氨芐青霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后采用菌落PCR的方法篩選轉(zhuǎn)化子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)后，PCR鑒定出陽(yáng)克隆，將陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。

1.2.3 金花茶CnIPI基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

根據(jù)CnIPI保守序列設(shè)計(jì)5′ 末端RACE引物RSP5（5′-CCAGAGGGAATGTTACCTTGGTCGC AGA-3′） 和 5′末端RACE引 物RSP3（5′- CAGATGCTGGTGAGGGGGGTTTGAAG-3′），利用RACE試劑盒分別克隆CnIPI基因的3′和5′末端序列，連接pGEM-T easy載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后送交深圳華大基因測(cè)序。參照周興文等[18]的方法將CnIPI基因3′、5′末端序列和保守片段序列拼接，然后根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)CnIPI全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)（FS1，5′-CCTTCTCTCCTCGCTCTTCC-3′； FA1，5′- CCCAGGCTTTACACTTTATGC -3′）進(jìn)行擴(kuò)增，將全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物連接pGEM-T easy并進(jìn)行序列測(cè)定以確認(rèn)、獲得該基因。

1.2.4CnIPI基因的生物信息學(xué)分析

CnIPI基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析參考周興文等[19]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶CnIPI基因的獲得

利用SP/AP引物對(duì)，成功從金花茶花瓣cDNA中擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約550 bp的同源片段（圖1）。將該片段序列在NCBI上BLAST，結(jié)果顯示該序列與多個(gè)物種IPI基因具有很高相似性，表明該基因片段為IPI基因保守片段。

2.2 金花茶CnIPI基因全長(zhǎng)獲得與序列分析

利用5′末端RACE引 物RSP5和3′末端RACE引物RSP3進(jìn)行RACE擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度為507 bp的5′末端序列（圖2-B）和長(zhǎng)度為605 bp的3′末端序列（圖2-A）。利用全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)FS1/FA1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了916 bp的全長(zhǎng)序列（圖2-C）。測(cè)序結(jié)果表明，該全長(zhǎng)序列與電子拼接結(jié)果一致。ORF Finder分析表明，CnIPI基因含有一個(gè)最大長(zhǎng)度為747 bp的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame,ORF），編碼248個(gè)氨基酸（圖3）。

圖1 金花茶IPI基因片段擴(kuò)增電泳圖Fig.1 The electrophoresis of amplified IPI fragment from Camellia nitidissima

圖2 金花茶CnIPI基因RACE及全長(zhǎng)擴(kuò)增電泳圖Fig.2 RACE and full length cDNA fragments agarose gel electrophoresis analysis of CnIPI gene from C.nitidissima

2.3 金花茶CnIPI基因編碼蛋白質(zhì)特征分析

圖3 金花茶CnIPI基因cDNA全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列Fig.3 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of CnIPI

ProtParam 軟件分析結(jié)果顯示，CnIPI基因所編碼蛋白質(zhì)的原子總數(shù)為3 907，蛋白質(zhì)分子量為27.97 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為4.98，不穩(wěn)定系數(shù)為25.36，為穩(wěn)定親水性蛋白。SignalP4.1Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CnIPI序列不具有信號(hào)肽。用PSORT Prediction在線預(yù)測(cè)CnIPI亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中的可能性最大。用Predict Protein預(yù)測(cè)CnIPI二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主，所占比例為59.87%；其次為α-螺旋，所占比例為28.63%，β-折疊所占比例最少，為12.50%。用SWISS-MODEL 對(duì)金花茶CnIPI 編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模預(yù)測(cè)，結(jié)果表明CnIPI 編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符（圖4）。利用NCBI Conserved Domain Search 進(jìn)行保守域結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該蛋白具有 一 個(gè)PLN02552（Isopentenyl-diphosphate deltaisomerase）結(jié)構(gòu)域以及Nudix hydrolase superfamily結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖4 金花茶CnIPI編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The predicted tertiary structure of CnIPI protein in C.nitidissima

2.4 金花茶CnIPI基因編碼蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)與同源性分析

圖5 金花茶CnIPI基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Conserved Domain analysis of CnIPI protein in C.nitidissima

利用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的金花茶CnIPI基因編碼蛋白與其他物種的IPI蛋白序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖6）表明，金花茶CnIPI蛋白與其它物種的IPI蛋白序列具有很高的同源性。金花茶CnIPI蛋白與茶Camellia sinensis、月季Rosa chinensis、杜鵑Rhododendron japonicum等植物的同源性高達(dá)86%。

圖6 金花茶CnIPI與其他物種IPI氨基酸序列的同源性分析Fig.6 Homology analysis of CnIPI amino acid sequence of Camellia nitidissima and and other species

3 結(jié)論與討論

本論文利用同源克隆的方法，根據(jù)GenBank中已公布的IPI序列，通過(guò)分析其保守區(qū)并設(shè)計(jì)相關(guān)引物，成功從金花茶花瓣中克隆得到了長(zhǎng)550 bp的IPI同源片段。BLAST分析表明，該基因核苷酸序列與多個(gè)植物IPI序列的相似性均在90%以上，表明克隆得到的cDNA片段序列應(yīng)為金花茶IPI序列。根據(jù)得到的DNA片段的序列分別設(shè)計(jì)了5′ RACE和3′ RACE克隆的引物，利用RACE克隆技術(shù)，分別獲取了該基因的5′和3′末端序列。最后，根據(jù)拼接的電子序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，成功克隆了金花茶CnIPI全長(zhǎng)cDNA序列。

生物信息學(xué)分析表明，該CnIPI基因含有一個(gè)最大長(zhǎng)度為747 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼248個(gè)氨基酸，表明CnIPI是一條完整的基因序列。該IPI蛋白氨基酸數(shù)量比冬凌草[15]、臘梅[9]少，比滇龍膽[7]、丹參[14]多。此外，該基因編碼的CnIPI蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主，β-折疊所占比例最少，與滇龍膽[7]IPI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例不同。這些不同之處表明該基因具有一定的物種特異性。CnIPI蛋白含有一個(gè)典型的異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase）結(jié)構(gòu)域和Nudix hydrolase superfamily結(jié)構(gòu)域，與滇龍膽[7]、丹參[14]、臘梅[9]等物種的IPI蛋白結(jié)構(gòu)域相似，該CnIPI的氨基酸序列與其它物種的氨基酸序列對(duì)比結(jié)果表明，金花茶CnIPI蛋白與茶Camellia sinensis、月季Rosa chinensis、杜鵑Rhododendron japonicum等植物的同源性高達(dá)86%，推測(cè)金花茶CnIPI與臘梅、月季等物種IPI具有相似的萜類(lèi)物質(zhì)合成功能。

類(lèi)胡蘿卜素是廣泛存在于自然界的一類(lèi)萜類(lèi)化合物[5]。大量研究表明，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因IPI是調(diào)控萜類(lèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵酶基因[20-22]，IPI基因的表達(dá)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的合成和積累具有非常重要的作用[23-25]。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了金花茶花瓣IPI基因cDNA全長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究該基因的功能及金花茶花瓣類(lèi)胡蘿卜素合成的分子機(jī)理奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在后續(xù)的試驗(yàn)中，將繼續(xù)利用相關(guān)的基因工程技術(shù)，構(gòu)建該CnIPI基因的原核和真核表達(dá)載體，對(duì)該基因的功能進(jìn)行深入研究。