樟樹成熟種子超低溫保存研究

馬健 葉潤燕 張俊紅

摘要 [目的] 研究樟樹成熟種子保存的最佳方法。[方法]利用正交試驗對樟樹種子進(jìn)行超低溫保存，探討樟樹成熟種子保存的最佳方法。[結(jié)果]樟樹種子超低溫保存過程中種子最佳含水量為26%；在樟樹種子超低溫保存過程中，15%二甲基亞砜是最好的冷凍保護(hù)劑之一；最利于樟樹種子超低溫保存的解凍方式是慢凍和慢解凍。[結(jié)論]該研究為研究樟樹種子低溫保存提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 樟樹；超低溫；保存

中圖分類號 S792.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0170-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.049

Abstract [Objective] To study the best method and conditions to protect the seed activity of Cinnamomum camphora Presl in the process of seed preservation. [Method] The seeds of C.camphora were cryopreserved by orthogonal test， and the conductivity of the preserved seeds and the dehydrogenase in vitro were determined. [Result] 26% was the optimal water content of camphor seeds in the process of cryopreservation. 15% dimethyl sulfoxide was one of the best cryoprotectants in the cryopreservation of C.camphora . Slow freezing and slow thawing were the most favorable methods for the cryopreservation of seeds. [Conclusion] This study could provide theoretical basis for the study on the cryopreservation of C.camphora seeds.

Key words Cinnamomum camphora Presl；Ultralow temperature；Conservation

隨著原始森林面積的銳減，大量物種種質(zhì)資源不斷流失，尤其是木本種植資源，所以對木本種植資源的保存開始受到越來越多的關(guān)注。種子作為木本植物種質(zhì)資源保存最普遍也是最佳的保存材料之一，在珍稀樹種種植資源的保存中發(fā)揮著越來越大的作用。但珍稀樹種的種子大多為頑拗性種子，目前采用常規(guī)方法難以長期保存，而超低溫保存則多次在頑拗性種子中獲得成功[1-4]。筆者采用正交試驗對樟樹種子進(jìn)行超低溫保存，并對其保存后的種子進(jìn)行電導(dǎo)率測定以及對其離體胚進(jìn)行脫氫酶測定，探討在保存過程中最利于保護(hù)種子活性的方法和條件，以期為實現(xiàn)樟樹種子長期貯藏提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用種子為20～30年生，生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良樟樹單株上采摘的成熟果實。

1.2 含水量測定

1.2.1 絕對含水量測定。根據(jù)國際林木種子檢驗規(guī)程（SIAT）的規(guī)定，采用105 ℃烘干8 h來測定絕對含水量。

ω0=（鮮重-絕干重/鮮重）×100%

1.2.2 實際含水量測定。每組選擇大小均勻、顆粒飽滿、無損傷的樟樹種子10顆，每個梯度測定3組，共12組，放入30 ℃烘干箱中加硅膠使種子失水至實際含水量分別為33%、26%、20%、14%。試驗同時測定種子的絕對含水量，失水過程中經(jīng)常更換硅膠。實際含水量采用減重法計算：ω1=100%-[最初重量×（100%-相對含水量）]/最后重量。

1.3 冷解凍程序 樟樹種子超低溫保存的冷解凍程序如圖1所示。

1.4 相對電導(dǎo)率的測定

選擇大小均勻、顆粒飽滿、無損傷的種子10顆，稱重后用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，用濾紙吸干浮水，分別裝入50 mL試管中加入10 mL重蒸水浸泡，再用DDS-307型電導(dǎo)率儀先測定電導(dǎo)值，即為初始值（a1），此后每隔4 h測定電導(dǎo)率（a2），同時記錄水溫，直至24 h結(jié)束。然后，將浸泡液連同種子在沸水中煮15 min，冷卻至25 ℃后再測定電導(dǎo)率（a3）。以不加種子的重蒸水為空白對照。按以下公式計算絕對電導(dǎo)率：

絕對電導(dǎo)率（μS/cm）=（種子電導(dǎo)率測定值-空白對照的電導(dǎo)率）×電極常數(shù)[5]；

然后，換算為25 ℃時電導(dǎo)率：25 ℃電導(dǎo)率=電導(dǎo)率×[1+0.02 ×（t-25）][6]；按以下公式計算相對電導(dǎo)率：相對電導(dǎo)率Sr（%）=S1/S2×100，式中S1為25 ℃電導(dǎo)率，S2為絕對電導(dǎo)率。

1.5 脫氫酶活性（TTC含量）的測定

取待測種子3個重復(fù)，每重復(fù)20粒種子，在45 ℃溫水中浸種24 h（以增強離體胚的呼吸強度，使其迅速顯色），取胚放入10 mL試管中，加入5 mL 0.1%TTC溶液，加蓋，在37 ℃黑暗條件染色8 h，充分染色后，倒出TTC 溶液，并用蒸餾水沖洗3次。然后，再將樣品中加入丙酮及少許石英充分研磨。將研磨液倒入2 mL的試管中，用丙酮定容。將試管置于4 000 r/min下離心10 min。取上清液在490 nm波長下使用72-1型分光光度計測定光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相應(yīng)還原態(tài)的TTC含量。

1.6 試驗設(shè)計

按L16（42×25）正交試驗設(shè)計，含水量33%、26%、20%、14%共4個不同水平梯度；冷凍方式包括快速冷凍和慢速冷凍；解凍方式包括快速解凍和慢速解凍；冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜、蔗糖和乙二醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為5%、10%、15%、20%和5%、10%，試驗設(shè)計方案見表1～2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含水量對樟樹成熟種子超低溫保存的影響

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性是種子活力的基礎(chǔ)[7]，當(dāng)種子老化劣變時，細(xì)胞膜受到損傷甚至解體，膜透性增大，電解質(zhì)外滲，水浸液電導(dǎo)率上升[8]，所以測定的相對含水量越大，其種子活性越低。脫氫酶是種子呼吸過程中一種重要的還原酶，其活性與種子的發(fā)芽力密切相關(guān)[9]，與種子的呼吸強度呈正相關(guān)，而OD值能反映脫氫酶的活性，TTC含量越高，種子活性越強。

由表3和表4可知，無論是相對電導(dǎo)率測定還是TTC含量測定，其中B（含水量）的R值最大，含水量對二者的影響極顯著，這說明在種子超低溫保存過程中含水量的影響最顯著。B2和B3即當(dāng)種子含水量為20%～26%時，種子經(jīng)過超低溫保存后活性較高。LSD比較結(jié)果表明，B2和B3對結(jié)果的影響極顯著。綜合考慮，樟樹種子超低溫保存過程中種子最佳含水量為26%。

2.2 不同冷解凍方式對樟樹成熟種子超低溫保存的影響

表3中通過對相對電導(dǎo)率的級差分析發(fā)現(xiàn)，冷解凍方式的R值分別為31.38和17.86，說明冷解凍方式對樟樹種子超低溫保存相對電導(dǎo)率有極大影響。表4中冷凍方式的R值為12.21，P<0.05，影響達(dá)到顯著水平，而解凍方式對結(jié)果的影響不顯著，說明僅冷凍方式對樟樹種子超低溫保存TTC含量有較大影響。

表3中C2（即慢凍方式）的超低溫保存種子的相對電導(dǎo)率較小，種子活性較高；表4中慢凍方式的超低溫保存過程后TTC含量較高，種子活性較高。表3中解凍方式K1>K2，表明D2即慢解凍方式種子經(jīng)超低溫保存后相對電導(dǎo)率較低。綜上所述，最利于種子超低溫保存的解凍方式為慢凍和慢解凍。

2.3 不同冷凍保護(hù)劑對樟樹成熟種子超低溫保存的影響

通過方差分析發(fā)現(xiàn)，無論測定相對電導(dǎo)率還是TTC含量，E和F因素的P值均大于0.05，所以該試驗中冷凍保護(hù)劑的蔗糖和乙二醇含量對樟樹種子超低溫保存的影響不大。A因素的方差分析P值均小于0.05，說明A因素（二甲基亞砜含量）對樟樹種子超低溫保存的影響顯著。

表3中A因素的K3值最小，說明A3的相對電導(dǎo)率值較低，通過LSD分析發(fā)現(xiàn)A3和A2、A4的P值分別為0.003和0.018；A3和A1的P值為0.401，影響不顯著。這表明二甲基亞砜含量為A1或A3（即5%或15%）時，種子經(jīng)過超低溫保存后活性較高。表4中通過LSD比較發(fā)現(xiàn)A3和A1的P值為0.023，影響達(dá)到顯著水平，說明在樟樹種子超低溫保存過程中A3因素（即15%的二甲基亞砜）比二甲基亞砜含量為5%時能更好地保護(hù)種子活性。綜合考慮，在樟樹種子超低溫保存過程中，15%二甲基亞砜是最好的冷凍保護(hù)劑。

3 討論

通過正交試驗對樟樹種子超低溫保存后相對電導(dǎo)率和脫氫酶活性（TTC含量）進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏材料（包括種子和離體胚）的含水量是超低溫保存成功與否的關(guān)鍵因素，尤其是在頑拗性種子的超低溫保存過程中，適度脫水能在超低溫冷凍或解凍過程中避免或減輕低溫傷害，是超低溫保存成功的關(guān)鍵[10-12]。冷凍方式和解凍方式的選擇則是對超低溫保存過程中劇烈降溫和升溫的控制，是超低溫保存的輔助手段。冷凍保護(hù)劑在超低溫過程中對劇烈溫度變化有很好的緩沖作用，但由于冷凍保護(hù)劑本身對材料有毒害作用，所以適宜的種類和濃度是冷凍保護(hù)劑選擇的關(guān)鍵。該研究探討了樟樹種子超低溫保存的最佳條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適度脫水至含水量為26%時的樟樹種子在含15%二甲基亞砜的冷凍保護(hù)劑保護(hù)下，經(jīng)過慢冷凍和慢解凍的方式在超低溫保存過程中能最大限度減少細(xì)胞損傷，保持種子活性。

目前超低溫保存作為一種重要的種子保存技術(shù)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。尤其是對頑拗性種子而言，超低溫保存因其操作簡便、投入少，保存種子遺傳穩(wěn)定、易出現(xiàn)抗寒新品種等優(yōu)點成為最佳貯藏手段。成功保存頑拗性種子的報道也不斷出現(xiàn)[3，13]，但總體來說研究工作尚處于起步階段，種子超低溫保存還存在許多問題有待解決，如保存后的存活率低、正常成苗困難等。

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