山茶灰斑病病原菌鑒定及防治藥劑初步篩選

張曉勇 李樹江 王亮 楊友聯(lián)

摘要 為明確引起貴州六盤水山茶灰斑病的致病菌種類和防治方法，用單孢分離法獲得3株菌株。通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS、β-tubulin、tef1多基因序列進(jìn)行分析，確定該病原菌為葡萄牙擬盤多毛孢Pestalotiopsis portugalica。6種常規(guī)殺菌劑室內(nèi)藥效測定結(jié)果表明，50%多菌靈可濕性粉劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種苯并咪唑類殺菌劑在推薦濃度范圍內(nèi)對P.portugalica的抑制率達(dá)到了100%，75%百菌清可濕性粉劑在推薦濃度范圍內(nèi)對該病原菌的抑制率也在90%以上;有效成分濃度為250～500 mg/L的70%代森錳鋅可濕性粉劑和75～300 mg/L的75%百菌清可濕性粉劑可顯著促進(jìn)P.portugalica產(chǎn)孢。

關(guān)鍵詞 山茶; 擬盤多毛孢; 灰斑病; 形態(tài)特征; 多基因序列分析; 殺菌劑

中圖分類號： S 436.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018331

山茶Camellia japonica L.是集觀賞和藥用于一身的經(jīng)濟(jì)價值較高的中國傳統(tǒng)園林花木。山茶輪紋?。╮ing-rot disease）、炭疽?。╝nthracnose）、枯梢?。╯hoot blight）和灰斑?。╣ray leaf spot）等是山茶栽培中最常見的幾種病害[1]，常導(dǎo)致較大的經(jīng)濟(jì)損失。其中山茶灰斑病最為常見，葉部病斑多發(fā)生于葉緣，呈不規(guī)則形，灰褐色至灰白色，邊緣暗褐色，病健交界明顯，孢子堆（分生孢子盤）黑色，呈球狀或卵圓狀，病害嚴(yán)重時導(dǎo)致大量葉片枯萎，嫩枝表皮縱裂，嚴(yán)重影響山茶的生長。前人研究發(fā)現(xiàn)，山茶灰斑病主要由擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis Steyaert真菌引起，已報道的病原有污斑擬盤多毛孢P.maculans （Corda） Nag Raj[2]、白珠樹擬盤多毛孢P.gaultheriae Dearn. & House[3]、長剛毛擬盤多毛孢P.longiseta （Speg.） K. Dai & Tak. Kobay[4]、山茶擬盤多毛孢P.camelliae Yan M. Zhang， Maharachch. & K.D.Hyde[5]和葡萄牙擬盤多毛孢P.portugalica Maharachch.， K. D.Hyde & Crous[6]。

本研究于2014年8月在貴州六盤水市一苗圃場采集到有明顯灰斑病癥狀的山茶葉片，經(jīng)挑取病斑內(nèi)的呈黑色小顆粒狀的孢子堆鏡檢，發(fā)現(xiàn)其分生孢子和分生孢子盤具有顯著的擬盤多毛孢屬真菌特征。為準(zhǔn)確鑒定采集分離的病原菌種類，采用形態(tài)學(xué)ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Internal transcribed spacer）、β-tubulin（β-微管蛋白）、tef1（翻譯延伸因子Translation elongation factor 1）等基因的序列分析相結(jié)合的方法，對病原菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行室內(nèi)殺菌劑藥效測定，旨在為山茶灰斑病的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

采用單孢分離法對病原菌進(jìn)行分離和純化[7]，獲得3株菌株（編號為LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）。菌株在PDA斜面上培養(yǎng)7～10 d后置于4℃保存。

1.2 病原物形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.1 菌株活化與生長速率測定

將4℃條件下保存的3個菌株轉(zhuǎn)接至2% PDA（新鮮馬鈴薯20 g煮汁過濾后加入2 g蔗糖，15 g瓊脂，用水定容至1 000 mL）平板，于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后以5 mm直徑打孔器從菌落邊緣打取菌塊，接入另一PDA平板中央，5個重復(fù)，25℃下黑暗培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，觀察菌落特征。

1.2.2 產(chǎn)孢細(xì)胞及分生孢子的誘導(dǎo)

將4～6根經(jīng)雙重滅菌的松針置于SNA培養(yǎng)基（KH2PO4 0.2 g，KCl 0.2 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 蔗糖0.4 g，瓊脂15 g，用水定容至1 000 mL）平板表面誘導(dǎo)其產(chǎn)生分生孢子[8]。待松針上有黑褐色孢子堆形成后在體視鏡下挑取孢子堆制片，用正置顯微鏡（Olympus BX51）拍攝產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的顯微結(jié)構(gòu)，并測量大小。

1.3 病原菌的分子鑒定

1.3.1 病原菌DNA提取

將供試菌株分別接種于PDA平板上，置于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后刮取菌絲，用改良的CTAB法提取DNA[9]。

1.3.2 基因組DNA檢測

取2 μL總基因組DNA樣品進(jìn)行電泳檢測 （1.2%瓊脂糖凝膠、0.5×TAE電泳緩沖液，5 V/cm電壓）。

1.3.3 目的基因的擴(kuò)增與序列測定

擴(kuò)增的目的序列分別為ITS、β-tubulin和tef1三個基因片段。ITS基因選用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）;β-tubulin基因選用引物BT2A（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）;tef1基因選用引物EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATA-CCACCRATCTT-3′）[10]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板2 μL。擴(kuò)增ITS的PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增β-tubulin的PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min;94℃變性48 s，55℃退火48 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán);72℃延伸5 min擴(kuò)增tef1的PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性18 s，54℃退火33 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由成都柏輝生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。

1.3.4 序列分析

將本試驗分離的3個菌株所測得的ITS、β-tubulin和tef1序列與從GenBank中下載的33個模式菌株或公認(rèn)菌株對應(yīng)的基因序列（表1）用Clustalx 2.0軟件進(jìn)行比對，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株號：MFLUCC 120652）為外類群，以Paup*4.0 beta 10軟件以最大簡約法（maximum parsimony， MP）進(jìn)行分析，以啟發(fā)式搜索法（heuristic search）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析供試菌株的分類地位[11]。

1.4 殺菌劑對病原菌室內(nèi)藥效測定

采用含藥PDA平板測定殺菌劑藥效[12]。參照商品農(nóng)藥推薦使用濃度范圍，6種殺菌劑及其有效成分濃度梯度分別設(shè)置為：50%多菌靈可濕性粉劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑75、150、300、600、1 200 mg/L;75%百菌清可濕性粉劑75、150、300、600、1 200 mg/L;70%代森錳鋅可濕性粉劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L;15%三唑酮可濕性粉劑50、100、150、200、250 mg/L和37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑5、15、25、50、100 mg/L。在60℃的PDA培養(yǎng)基中分別添加相應(yīng)質(zhì)量的商品制劑，混合后制成含藥平板，以添加無菌水為對照組，每個處理3個重復(fù)。以5 mm直徑打孔器打取活化的純培養(yǎng)物接種到含藥平板，在25℃下避光培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測定各平板上菌落直徑，并計算抑菌率[13]，若產(chǎn)生孢子堆，則計算分生孢子堆密度。數(shù)據(jù)運(yùn)用DPS v 7.05以LSD法進(jìn)行單因素方差分析。

抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-5 mm）×100%;

分生孢子堆密度（個/mm2）=孢子堆數(shù)量/菌落面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茶灰斑病的發(fā)病癥狀

如圖1所示，在山茶葉片上，葉部病斑近圓形或不規(guī)則形，多從葉片邊緣開始形成并逐漸擴(kuò)大，初期水漬狀，呈黑褐色，病健交界明顯，后期病斑部位擴(kuò)大并逐漸干枯呈灰色，葉表皮組織易脫落，嚴(yán)重者形成缺刻或穿孔。病斑內(nèi)形成球狀隆起的小黑點，分布稀疏，直徑300～1 500 μm不等。葉部病斑小黑點部位橫切面可見分生孢子盤，孢子盤上可清晰看到產(chǎn)孢細(xì)胞和未脫落的分生孢子，分生孢子（15～20）μm×（5～6）μm，呈梭形，具有4個隔，5個細(xì)胞，中部細(xì)胞顏色呈深棕色，頂端有附屬絲1～3條，具有顯著的擬盤多毛孢屬真菌特征。

2.2 山茶灰斑病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

山茶灰斑病分離菌株形態(tài)學(xué)特征如圖2所示。3株菌株在2%PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落平均直徑均為（7.65±0.23）cm（n=5），生長速度為（10.92±0.35）mm/d。培養(yǎng)物菌落呈同心環(huán)狀，疏松，絨毛狀，未產(chǎn)分生孢子堆，菌落背面淡黃色（圖2a），初步鑒定3株菌株屬于同一個種。

在SNA培養(yǎng)基中的松針上所形成的孢子堆呈黑褐色球形，直徑200～500 μm，為半流動狀的黑色黏液團(tuán)，其基部嵌入松針表皮生長（圖2b）。在顯微鏡下，其分生孢子梗倒棍棒狀，有隔，透明，基部1～2個不規(guī)則分支，長短不一。產(chǎn)孢細(xì)胞簇生，呈球形、圓柱形或安瓿瓶狀，長度8.0～20.0 μm （±SD=13.52 μm±3.68 μm，n=15），透明，寬2.2～4.6 μm（±SD=2.99 μm±0.75 μm，n=15）（圖2c～d）。分生孢子紡錘形，直，偶稍有彎曲，4個隔將分生孢子分為5個細(xì)胞，分生孢子大小為（16.3～22.5）μm×（4.4～7.1）μm （±SD=（20.5±2.1）μm×（5.4±0.7）μm， n=30）;基部細(xì)胞倒圓錐狀，與中部細(xì)胞之間接觸平截面較小，長度2.5～5.4 μm （±SD=4.3 μm±0.6 μm， n=30），透明，薄壁。中間3個細(xì)胞呈甕狀至近圓柱形，厚壁且有小疣突，長度10.2～17.3 μm （±SD=12.5 μm±1.6 μm， n=30），隔處略微縊縮，3個細(xì)胞顏色相同，淺棕黃色至深棕黑色，隔膜較周圍細(xì)胞顏色更深，其中第2個細(xì)胞長2.9～5.8 μm （±SD=4.4 μm±0.7 μm， n=30），第3個細(xì)胞長3.5～5.9 μm （±SD=4.2 μm±0.5 μm， n=30），第4個細(xì)胞長3.3～5.6 μm （±SD=3.9 μm±0.6 μm， n=30）。頂部細(xì)胞圓錐狀，隔膜處顯著收縮，細(xì)胞壁較薄、光滑，細(xì)胞呈透明狀，長度2.8～5.3 μm （±SD=1.7 μm±0.6 μm， n=30）。頂部細(xì)胞頂部具1～3根管狀附屬絲，透明，尖端絲狀，附屬絲從頂部細(xì)胞的頂部共點分支或從主附屬絲上多回分支，長度10～25 μm （±SD=15.3 μm±3.9 μm， n=30）?；扛綄俳z（中生柄）無或1條，透明，管狀，長度1～4 μm （±SD=2.4 μm±1.5 μm， n=30），分生孢子基部中生（圖2e～l）。

通過對代表性菌株的進(jìn)一步培養(yǎng)和顯微形態(tài)觀察，并與該屬已知種相比較，將所分離的3株菌株初步鑒定為Pestalotiopsis portugalica Maharachch.， K. D.Hyde & Crous[6，8]。

2.3 病原菌多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析

將本試驗分離的3株菌株所測得的ITS、β-tubulin和tef1序列與從GenBank中下載的33個模式菌株或公認(rèn)菌株對應(yīng)的基因序列用ClustalX 2.0進(jìn)行比對，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株號：MFLUCC 12-0652）為外類群，并以Heuristiv Search構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。在該樹中，本研究分離的3個菌株（LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）都與P.portugalica模式菌株及其他菌株聚為一支，支持率為100%，支持了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

2.4 菌株對不同殺菌劑的敏感性

如表2所示，與對照相比，所有處理下菌株LPSU 2014023的菌落直徑都顯著減小，其中50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP的4個高濃度（有效成分，下同）和其他4種殺菌劑的最高濃度處理直接導(dǎo)致接種的菌餅上的菌絲死亡，抑菌率100%。當(dāng)75%百菌清WP濃度降低至75 mg/L，70%代森錳鋅WP濃度降至125 mg/L，15%三唑酮WP濃度降至150 mg/L和37%苯醚甲環(huán)唑WG濃度降至25 mg/L時對病原菌抑制率降低至85%以下，防效顯著降低。說明在推薦濃度范圍內(nèi)，50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP對該病原菌的抑制效果最佳，而70%代森錳鋅WP、15%三唑酮WP和37%苯醚甲環(huán)唑WG在推薦濃度范圍內(nèi)抑菌效果相對較差。此外，從表2中還可以看出，濃度為250～500 mg/L的70%代森錳鋅WP和75～300 mg/L的75%百菌清WP可顯著促進(jìn)培養(yǎng)物產(chǎn)孢。

3 討論

擬盤多毛孢屬真菌廣泛分布于自然界，屬寄生性較弱的半知菌。傳統(tǒng)上對擬盤多毛孢屬真菌進(jìn)行分類以分生孢子大小、中間3個細(xì)胞的顏色和長度、附屬絲長度和形狀等形態(tài)特征作為依據(jù)，并將擬盤多毛孢屬真菌分為三大類有顯著區(qū)別的進(jìn)化群，第一個類群分生孢子的中間3個細(xì)胞呈顏色均勻的淺棕色或橄欖色，第二個類群為顏色均勻的暗黑色，第三個類群為雜色[14]，本文報道的3菌株即屬于第三個類群。但隨后多基因序列分析證明以顏色來進(jìn)行分類是不可靠的[10]，而且這些形態(tài)特征與菌株培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。山茶灰斑病主要由擬盤多毛孢屬真菌引起，已報道的擬盤多毛孢屬病原有污斑擬盤多毛孢[2]、白珠樹擬盤多毛孢[3]、長剛毛擬盤多毛孢[4]、山茶擬盤多毛孢[5] 和葡萄牙擬盤多毛孢[6]。本文采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS、β-tubulin和 tef1多基因序列分析確定山茶灰斑病的病原菌為葡萄牙擬盤多毛孢P.portugalica。

目前已知的葡萄牙擬盤多毛孢全部分離自山茶屬植物[15]，該真菌模式菌株（CBS393.48）最早于1948年采自葡萄牙，后由Maharachchikumbura等對其進(jìn)行系統(tǒng)的分類研究[6]。在分類學(xué)上，其近緣種有P.camelliae，P. furcata和P.novae-hollandiae，P.portugalica與3個近緣種的分生孢子結(jié)構(gòu)相似，且頂端附屬絲數(shù)量較少，不過3個近緣種的分生孢子大小分別為（23～34）μm×（5.5～9.0）μm[5，8]、（29～39）μm×（8.5～10.5）μm[16]和（25～32）μm×（8～10）μm[6]，與P.portugalica的分生孢子大小有明顯的區(qū)別。Liu等[8]從采集自江西省廬山植物園的山茶上分離到該種（菌株號：LC4360和LC0670）。本研究首次在我國西南地區(qū)從山茶灰斑病病斑上分離到葡萄牙擬盤多毛孢。

多菌靈和甲基硫菌靈都屬于苯丙咪唑類殺菌劑，其作用機(jī)理都是抑制真菌細(xì)胞β-微管蛋白合成，阻礙正常有絲分裂[17]。從本研究試驗結(jié)果來看，在推薦濃度范圍內(nèi)，苯丙咪唑類殺菌劑對菌株LPSU 2014023的抑制效果最佳，這與前人獲得的藥劑對擬盤多毛孢屬病原菌室內(nèi)抑菌效果一致[1819]。但苯丙咪唑類殺菌劑在人畜安全性上一直被人們所詬病，而且作用位點單一，病原菌極易產(chǎn)生抗性[20]，Omatsu等研究表明分離自日本鹿兒島市茶葉種植區(qū)的P.longiseta菌株已對苯丙咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性[21]。百菌清可破壞真菌細(xì)胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD）活性，使真菌細(xì)胞糖代謝受損[22]。在該試驗中百菌清在推薦濃度范圍內(nèi)對所分離的病原菌表現(xiàn)出較好的抑制效果。代森錳鋅可抑制真菌細(xì)胞丙酮酸的氧化，且錳和鋅元素可促進(jìn)植物生長及提高抗性，多位點保護(hù)，不易產(chǎn)生抗藥性[23]，本試驗表明70%代森錳鋅WP在1 000 mg/L以上才能達(dá)到100%的抑制效果，而在250～500 mg/L濃度下會促進(jìn)所分離的病原菌產(chǎn)孢，增強(qiáng)其對不良環(huán)境的抵抗能力。三唑酮和苯醚甲環(huán)唑都是真菌甾醇生物合成抑制劑[24]，可導(dǎo)致真菌細(xì)胞裂解死亡，本研究表明，在推薦濃度范圍內(nèi)這兩種甾醇合成抑制劑抑菌效果并不理想。鑒于此，建議在擬盤多毛孢屬真菌引起的病害防治中，應(yīng)多種殺菌劑混合使用或交替使用，以提高防治效果和避免產(chǎn)生抗藥性。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）