美人蕉黃斑駁病毒巢式PCR檢測(cè)方法的建立

陳細(xì)紅 楊小龍 廖富榮 高芳鑾 沈建國(guó)

摘要 本文以我國(guó)臺(tái)灣進(jìn)境美人蕉病株為材料，根據(jù)已報(bào)道的美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（外側(cè)引物1對(duì)、內(nèi)側(cè)引物1對(duì)），建立了巢式PCR快速檢測(cè)CaYMV的方法，并對(duì)進(jìn)境的50份美人蕉樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，且靈敏度高于常規(guī)PCR，是常規(guī)PCR的1 000倍，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)CaYMV的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)，適用于口岸快速檢測(cè)CaYMV。

關(guān)鍵詞 美人蕉黃斑駁病毒; 巢式PCR; 檢測(cè)

中圖分類號(hào)： Q 503， S 41-30

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018283

美人蕉Canna indica L.是美人蕉科Cannaceae美人蕉屬Canna的一種多年生草本花卉，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有一定的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，在我國(guó)常作為一種園林觀賞植物進(jìn)行引種栽培[14]。美人蕉在生長(zhǎng)過程中易受病毒侵染，國(guó)內(nèi)外關(guān)于美人蕉病毒病的研究較少，目前已報(bào)道的美人蕉病毒有菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus（BYMV）[5]、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、美人蕉矮化類病毒Canna stunt viroid[67]、美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）[8]、美人蕉黃條病毒Canna yellow streak virus（CaYSV）[9]等。

美人蕉黃斑駁病毒（CaYMV）是美人蕉上的一種重要病毒，屬于花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae桿狀DNA病毒屬Badnavirus成員。其病毒粒體呈桿狀，長(zhǎng)約120～130 nm，直徑約28 nm[10]，基因組為不完全環(huán)狀雙鏈DNA，含3個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）。該病毒最早出現(xiàn)在日本和美國(guó)中北部[1113]，隨后在意大利、荷蘭[14]、印度[2]、肯尼亞[15]、中國(guó)[16]等國(guó)家陸續(xù)出現(xiàn)報(bào)道。CaYMV的寄主范圍較窄，已報(bào)道的自然寄主為美人蕉。受侵染的美人蕉生長(zhǎng)出現(xiàn)異常，典型癥狀為葉脈黃化，葉片、莖稈和花上出現(xiàn)條斑，組織逐漸壞死、變褐等，其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均受到影響[1011]。CaYMV主要通過無性繁殖材料傳播，可隨美人蕉種苗的運(yùn)輸進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，其傳播介體尚未明確，且目前尚缺乏有效的防治該病的方法。

為有效降低CaYMV的傳播和擴(kuò)散，急需建立針對(duì)該病毒快速、靈敏的檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)外針對(duì)CaYMV檢測(cè)方法的研究較少，沈建國(guó)等[10]報(bào)道了常規(guī)PCR檢測(cè)該病毒的方法。與常規(guī)PCR相比，巢式PCR方法檢測(cè)植物病毒具有更強(qiáng)的特異性和更高的靈敏度。張巧萍等[17]設(shè)計(jì)了鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物，建立了巢式PCR檢測(cè)方法，提高了檢測(cè)的靈敏度。聞偉剛等[18]通過建立煙草環(huán)斑病毒和番茄環(huán)斑病毒的半巢式RT-PCR檢測(cè)方法，靈敏度較常規(guī)RT-PCR方法提高了10 000倍以上。本文以我國(guó)臺(tái)灣進(jìn)境美人蕉病株為材料，根據(jù)已報(bào)道的CaYMV基因序列設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物（外側(cè)引物1對(duì)、內(nèi)側(cè)引物1對(duì)），建立了巢式PCR快速檢測(cè)CaYMV的方法，以期進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，以滿足口岸快速、準(zhǔn)確檢測(cè)CaYMV的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

CaYMV毒源為我國(guó)臺(tái)灣進(jìn)境的美人蕉病株。菜豆黃花葉病毒（BYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）以及番茄不孕病毒Tomato aspermy virus（TAV）的毒源（葉片）由本實(shí)驗(yàn)室保存。所有毒源均保存于-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

Plant Genomic DNA kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，2×Easy Taq PCR Supermix、TRIzol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，隨機(jī)引物、5×RT buffer、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、10 mmol/L dNTPs 購(gòu)自Promega 公司，10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、MgCl2、Taq DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

桿狀DNA病毒屬通用引物BadnaFP/BadnaRP：ATGCCITTYGGIAARAAYGCICC/CCAYTTRC-AIACISCICCCCAICC，目的片段576 bp[19]。

根據(jù)已報(bào)道的CaYMV基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，外側(cè)引物為：上游引物CaYMVF1：5′-TAG-GGCAGTCAAGGATTAAGC-3′;下游引物CaYMVR1：5′-CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為540 bp。內(nèi)側(cè)引物為：上游引物CaYMVF2：5′-ACTGCGTCAGTTTCTCGG-3′;下游引物CaYMVR2：5′-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小352 bp。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 總核酸的提取

利用Plant Genomic DNA kit提取樣品總DNA，方法參照試劑盒說明書。

1.5 PCR鑒定

以提取的DNA為模板，PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：2×Easy Taq PCR Supermix 12.5 μL，無菌水8.5 μL，BadnaFP（10 μmol/L）1 μL，BadnaRP（10 μmol/L）1 μL，DNA 2 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性7 min;94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 巢式PCR檢測(cè)

第一輪PCR以提取的DNA為模板，PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：10×PCR Buffer （Mg2+free） 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF1（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR1（10 μmol/L）1 μL，無菌水13.8 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA 2 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF2（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR2（10 μmol/L）1 μL，無菌水15.6 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，第一輪PCR產(chǎn)物0.2 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 序列測(cè)定及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的核苷酸序列在NCBI中運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行同源性比較分析。

1.8 巢式PCR的特異性驗(yàn)證

菜豆黃花葉病毒（BYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、番茄不孕病毒（TAV）提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同攜帶CaYMV的樣品DNA一起進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，同時(shí)以健康美人蕉植株的DNA為模板設(shè)陰性對(duì)照，以無菌水為模板設(shè)空白對(duì)照，反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同1.6。

1.9 巢式PCR的靈敏度測(cè)定

將CaYMV的DNA原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9不同稀釋度的DNA為模板，利用建立的巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，測(cè)定其靈敏度。

1.10 樣品檢測(cè)

利用建立的巢式PCR方法對(duì)口岸送檢的一批美人蕉樣品（共50份）進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法同1.4～1.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定

以提取的DNA為模板，以引物BadnaFP/BadnaRP進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果從美人蕉病株中擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶，約576 bp，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶（圖1）。將所得的目的片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，測(cè)得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已報(bào)道的CaYMV序列一致性達(dá)97%以上，證實(shí)樣品攜帶有CaYMV。

2.2 巢式PCR檢測(cè)

以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用設(shè)計(jì)的內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR，結(jié)果從帶毒樣品中擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶，約352 bp，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶（圖2）。將所得的目的片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，測(cè)得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已報(bào)道的CaYMV序列（GenBank登錄號(hào)：KT447042）一致性達(dá)99%。

2.3 巢式PCR的特異性驗(yàn)證

分別以BYMV、CMV、TAV的cDNA以及攜帶CaYMV的樣品DNA為模板，在相同條件下進(jìn)行巢式PCR，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，結(jié)果從圖3可見，僅攜帶CaYMV的樣品在352 bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，其他病毒樣品和健康樣品均無條帶，表明建立的巢式PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 巢式PCR的靈敏度測(cè)定結(jié)果

將攜帶CaYMV樣品的DNA按10倍梯度稀釋后，分別作為模板，單獨(dú)使用CaYMVF1/CaYMVR1進(jìn)行擴(kuò)增，在1～3泳道均能擴(kuò)增出540 bp的單一條帶（圖4a），而使用CaYMVF2/R2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，在泳道1～6均能擴(kuò)增出352 bp的條帶（圖4b）。第二輪PCR的檢測(cè)靈敏度比第一輪PCR高103倍，即巢式PCR使檢測(cè)靈敏度提高了103倍，由此表明，該病毒的巢式PCR的靈敏度明顯高于常規(guī)PCR，前者的靈敏度是后者的103倍。

2.5 樣品檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果表明，采用巢式PCR法能夠從50份美人蕉樣品中檢測(cè)出CaYMV 9份（檢出率為18%），比常規(guī)PCR檢出率（8%）高10個(gè)百分點(diǎn)，表明本文建立的巢式PCR方法具有更高的靈敏度。

3 討論

美人蕉黃斑駁病毒（CaYMV）是美人蕉上發(fā)生率較高的病毒之一，在美國(guó)、日本等美人蕉大面積種植的地區(qū)發(fā)生較為普遍，導(dǎo)致美人蕉的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。目前尚未有針對(duì)CaYMV有效的防治方法，在美國(guó)曾被迫采取銷毀病株的方式來防止其進(jìn)一步擴(kuò)散，給當(dāng)?shù)貛磔^大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。因此，加強(qiáng)病毒檢測(cè)，建立針對(duì)CaYMV快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)有效防止該病毒隨帶病植株的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸而擴(kuò)散，保護(hù)我國(guó)觀賞作物的生產(chǎn)安全意義重大。本文根據(jù)已報(bào)道的CaYMV序列設(shè)計(jì)了內(nèi)、外側(cè)2對(duì)特異性引物，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，建立了可用于CaYMV快速檢測(cè)的巢式PCR方法。

本文建立的巢式PCR方法僅能夠從感染CaYMV的樣品中擴(kuò)增到特異性目的片段，而從其他病毒樣品及健康樣品中均未擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段，提高了PCR擴(kuò)增的特異性，有效避免了非目的片段的擴(kuò)增。與常規(guī)PCR相比，本文建立的巢式PCR方法經(jīng)過2輪PCR反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度得到顯著提高，使整個(gè)PCR檢測(cè)靈敏度提高了1 000倍（第一輪、第二輪的檢測(cè)下限分別為10-2和10-5倍稀釋的DNA）。應(yīng)用本文建立的巢式PCR方法對(duì)進(jìn)境的美人蕉樣品進(jìn)行CaYMV檢測(cè)，檢出率為18%，明顯高于常規(guī)PCR的檢出率，因此當(dāng)CaYMV含量較低時(shí)，該方法能彌補(bǔ)常規(guī)PCR方法可能存在的漏檢問題，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。本文建立的巢式PCR檢測(cè)CaYMV的方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異和靈敏的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效應(yīng)用于CaYMV檢測(cè)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）