龍血竭總黃酮純化工藝研究

周云龍 彭霜 李江 李爭艷 余曉玲 陳凌云

摘要：目的? 建立龍血竭總黃酮的純化工藝。方法? 以龍血素A、龍血素B的吸附率和解吸率為評價指標(biāo)，采用大孔樹脂純化龍血竭總黃酮，確定最佳純化工藝。結(jié)果? 大孔樹脂純化龍血竭總黃酮的最佳工藝為：選擇D101大孔樹脂，用0.3%NaOH溶液溶解龍血竭乙酸乙酯提取物，上樣質(zhì)量濃度為12 mg/mL，上樣量為2 BV，上樣體積流量為1.0 BV/h，依次用純化水洗脫雜質(zhì)至流出液呈中性為止，再用80%乙醇5 BV洗脫。得到的龍血竭總黃酮含量以龍血素A和龍血素B計，比藥材中含量提高了3倍。結(jié)論? D101大孔樹脂可用于龍血竭總黃酮的純化，該工藝穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞：龍血竭;總黃酮;大孔樹脂;純化工藝

中圖分類號：R284.2??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0083-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.017????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To establish a purification process for total flavonoids from Dragons blood. Methods The adsorption rate and desorption rate of Loureirin A and Loureirin B were used to evaluate the purification process. The macroporous adsorption resin was used to purify the total flavonoids of Dragons blood， and the best process was determined. Results The optimal process for the purification of total flavonoids from Dragons blood by macroporous adsorption resin was as follows： D101 macroporous resin was selected， and the ethyl acetate extract of Dragons blood was dissolved in 0.3% NaOH solution. The concentration of the sample was 12 mg/mL. The loading amount was 2 BV. The loading volume was 1.0 BV/h. The impurities were eluted with purified water until the effluent was neutral， and then eluted with 80% ethanol 5 BV to obtain the total flavonoids of Dragons blood. The contents of Loureirin A and Loureirin B was increased by 3 times compared with the materia medica. Conclusion D101 macroporous resin can be used in the purification process of total flavonoids from Dragons blood. The process is stable and reliable.

Keywords： Dragons blood; total flavonoids; macroporous resin; purification process

龍血竭是百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis（Lour.）S. C. Chen的樹脂，主要含有黃酮類、皂苷類、酚類、有機(jī)酸、酯類和揮發(fā)油等成分，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌功效，用于跌打損傷、瘀血作痛、氣血凝滯、外傷出血、膿瘡久不收口。現(xiàn)代研究表明，龍血竭具有抗炎、鎮(zhèn)痛，活血、止血，抗細(xì)菌、真菌，改變血液流變學(xué)等藥理作用[1-5]。其中黃酮類成分是其主要有效成分，龍血竭中的黃酮類化合物主要有二氫查耳酮、查耳酮、黃烷、二氫黃酮和黃酮等[6-11]。有研究表明，龍血素A、B、C及7-羥基-4'-甲氧基黃烷、4'，7-二羥基高異黃烷具有體外活血化瘀藥理活性[12]。陳素等[13]研究表明，龍血竭總黃酮是龍血竭抗炎鎮(zhèn)痛的主要有效部位。目前，龍血竭總黃酮含量多采用比色法進(jìn)行測定，但由于龍血竭本身呈紅色，在比色法測定過程中會對顯色結(jié)果造成一定的影響，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確，故本研究采用HPLC測定總黃酮中的龍血素A、B，通過這2種成分含量來表征龍血竭總黃酮的含量，并以兩者的吸附率和解吸率為指標(biāo)進(jìn)行純化工藝研究。迄今尚未見使用大孔樹脂提取純化龍血竭總黃酮工藝的研究報道。因此，本研究考察大孔吸附樹脂對龍血竭總黃酮中龍血素A、龍血素B的靜態(tài)、動態(tài)吸附性能，篩選最優(yōu)純化工藝，為后續(xù)相關(guān)開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

AgiLent 1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），101-2ABA型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），CP124C型電子天平（奧豪斯儀器有限公司），RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團(tuán)），THZ-82A型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司），DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

龍血竭飲片，昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供;龍血素A對照品（批號110736-200934）、龍血素B對照品（批號111558-201006），中國食品藥品檢定研究院;大孔樹脂AB-8、HPD-100、HPD-100B、HPD-400、HPD-500、D101、NKA-9，聚酰胺，安徽三星樹脂科技有限公司;乙腈（色譜純），Merk股份有限公司;其余試劑均為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 指標(biāo)成分含量測定

2.1.1? 對照品溶液制備

分別取龍血素A、龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成分別含龍血素A、B含量分別為86.4、41.2 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2? 龍血竭飲片供試品溶液制備

取龍血竭飲片，用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過80目篩，即得龍血竭飲片粉末，備用。取龍血竭飲片粉末約0.1 g，精密稱定，用甲醇溶解并定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3? 龍血竭總黃酮供試品溶液制備

取本實(shí)驗(yàn)室制備的龍血竭總黃酮粉末約0.1 g，精密稱定，用甲醇使溶解并定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 檢測波長選擇

在200～400 nm波長范圍內(nèi)對龍血素A、B對照品溶液進(jìn)行掃描，從光譜圖可以看出龍血素A、B在波長275 nm處均有最大吸收，故選擇275 nm作為龍血素A、B的檢測波長。

2.1.5? 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DIKAM C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動相：乙腈-0.5%冰醋酸（26∶74）;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：275 nm;進(jìn)樣量：10 ?L。理論塔板數(shù)以龍血素A計算不低于6000。取龍血素A、B對照品溶液及龍血竭飲片供試品溶液各10 ?L，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。色譜圖見圖1。其中龍血素A、B的理論塔板數(shù)均大于15 000，分離度>2.0，拖尾因子滿足要求。

2.1.6? 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，分別精密吸取1、5、10、15、20、25 μL注入液相色譜儀，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。結(jié)果龍血素A回歸方程為Y=3735.9X-6.052 7（r2=0.999 9），表明在0.086 4～2.16 ?g范圍內(nèi)，龍血素A峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系;龍血素B回歸方程為Y=3131.7X-22.62（r2=0.999 9），表明在0.041 2～1.03 ?g范圍內(nèi)，龍血素B峰面積與進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好。

2.1.7? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取龍血素A、B對照品及供試品適量，依法制備對照品溶液和供試品溶液，于0、4、8、12、16 h，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液中，16 h內(nèi)龍血素A、B的峰面積RSD<2%，表明龍血素A、B的甲醇溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8? 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次龍血竭飲片粉末6份，各0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定龍血素A、B的含量。結(jié)果顯示，龍血竭飲片中龍血素A、B含量RSD=2.43%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9? 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取同一已知含量供試品溶液（含龍血素A 22.92 μg/mL、龍血素B 23.11 μg/mL）9份，每份5 mL，精密加入對照品溶液（含龍血素A 86.4 μg/mL、龍血素B 41.2 μg/mL）適量（5、10、15 mL，每個水平3份），加甲醇定容至25 mL，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定龍血素A、B的含量，計算加樣回收率。結(jié)果見表1、表2。龍血素A、B的平均加樣回收率分別為99.80%、98.85%，RSD均小于3%，表明本方法穩(wěn)定可靠。

2.2? 大孔樹脂篩選

2.2.1? 龍血竭總黃酮粗提物制備

按文獻(xiàn)[14]方法，用10倍量的乙酸乙酯回流提取2次，每次1 h，合并2次乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，60 ℃減壓干燥，備用。

2.2.2? 上樣液制備

取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物，用0.3%NaOH溶液溶解，配制成龍血竭總黃酮粗提物濃度為12 mg/mL的溶液，備用。

2.2.3? 大孔樹脂預(yù)處理

大孔樹脂先用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹，用95%乙醇沖洗，至醇液加水不產(chǎn)生渾濁為止，再用純化水洗至無醇味，備用。

2.2.4? 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

稱取預(yù)處理好的大孔樹脂AB-8、HPD-100、HPD-100B、HPD-400、HPD-500、D101、NKA-9、聚酰胺各2 g，置150 mL錐形瓶中，加入“2.2.2”項(xiàng)下上樣液20 mL，25 ℃恒溫振蕩器上振搖24 h，使其充分吸附，取出，過濾，取5 mL濾液，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL，過濾，取續(xù)濾液，測定龍血素A、B的含量。將濾出的樹脂放入150 mL錐形瓶中，各加入95%乙醇20 mL，將其置于25 ℃恒溫振蕩器上振搖24 h，使其充分解吸，取解吸液，過濾，取續(xù)濾液，測定龍血素A、B含量。分別計算龍血素A、龍血素B的吸附率、解吸率及回收率。吸附率（%）=（吸附前樣液濃度-吸附后樣液濃度）÷吸附前樣液濃度×100%，解吸率（%）=解吸后樣液濃度÷（吸附前樣液濃度-吸附后樣液濃度）×100%，回收率（%）=吸附率×解吸率×100%，結(jié)果取龍血素A和龍血素B的平均值，見表3。

可以看出，大孔樹脂HPD-100和D-101對龍血素A、B的回收率較高，兩者結(jié)果較接近，而大孔樹脂D-101的回收率最高，故選擇D-101為龍血竭總黃酮的分離樹脂。

2.2.5? 大孔樹脂D-101靜態(tài)吸附動力學(xué)特性

稱取預(yù)處理好的大孔樹脂D-101 2.0 g，置150 mL具塞三角錐形瓶中，加入“2.2.2”項(xiàng)下上樣液30 mL，置25 ℃恒溫振蕩器上振蕩，每隔30 min取樣1 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法處理樣品，測定龍血素A、B的含量，并計算吸附率，繪制大孔樹脂D-101的靜態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖2?？梢姡?.5 h以后大孔樹脂對龍血竭總黃酮的吸附基本達(dá)到飽和狀態(tài)。

2.2.6? 大孔樹脂D-101靜態(tài)解吸動力學(xué)特性

將“2.2.5”項(xiàng)下過濾出的樹脂置于150 mL具塞三角錐形瓶中，加入95%乙醇30 mL，置于25 ℃恒溫振蕩器上振蕩，每隔30 min取樣1 mL，測定龍血素A、B的含量，并計算解吸率，繪制大孔樹脂D-101的靜態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖3。可見，靜態(tài)解吸1 h后龍血竭總黃酮解吸基本完成。

2.3? 純化分離工藝研究

2.3.1? 上樣液濃度考察

稱取5份預(yù)處理好的大孔樹脂D-101各2.0 g，置150 mL具塞三角錐形瓶中，精密加入龍血竭總黃酮濃度分別為6.156、8.18、10.100、12.044、14.032 mg/mL的供試品溶液各25 mL，置于25 ℃恒溫振蕩器上振蕩2 h，取上清液，測定龍血素A、B的含量，計算吸附率，繪制吸附曲線，結(jié)果見圖4?？梢姡跐舛冗_(dá)到14.032 mg/mL時，大孔樹脂對龍血素A、B的吸附明顯下降，考慮吸附效率，選擇12.044 mg/mL為最佳上樣液濃度。

2.3.2? 上樣體積流量考察

將預(yù)處理好的大孔樹脂D-101濕法裝柱（1.0 cm×12 cm），龍血竭總黃酮上樣液為1 BV，控制上樣體積流量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h，測定漏出液中龍血素A、B的含量，計算吸附率。結(jié)果大孔樹脂對龍血素A的吸附率分別為93.64%、92.89%、87.21%、75.35%、62.31%，對龍血素B的吸附率為94.78%、94.25%、88.89%、74.45%、59.81%，見圖5。可見，吸附率隨上樣體積流量增大而減小，當(dāng)體積流速為1.5 BV/h時，大孔樹脂對龍血素A和龍血素B的吸附均出現(xiàn)大幅下降，可能由于樹脂與樣品溶液接觸時間過短，造成樹脂對總黃酮的吸附不完全，故選擇上樣體積流量為1.0 BV/h。

2.3.3? 上樣體積考察

將預(yù)處理好的大孔樹脂D-101濕法裝柱（1.0 cm×12 cm），將濃度為12 mg/mL的龍血竭總黃酮粗提液以1.0 BV/h體積流量上樣，每5 mL收集1管，測定龍血素A、B的含量，計算泄漏率，并繪制動態(tài)吸附曲線。泄漏率（%）=濾出液中龍血素A、B的含量÷上樣液中龍血素A、B的含量×100%。結(jié)果見圖6?？梢?，初始階段流出液中無龍血素A和龍血素B泄漏，當(dāng)上樣量增加到1.8 BV時，流出液中開始出現(xiàn)龍血素A和龍血素B，到2 BV時出現(xiàn)明顯泄漏，故選擇上樣體積為2 BV。

2.3.4? 乙醇濃度考察

稱取6份預(yù)處理好的大孔樹脂D-101各2.0 g，置于150 mL具塞三角錐形瓶中，加入一定量的龍血竭總黃酮上樣液，待吸附平衡后，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇30 mL，置于25 ℃恒溫振蕩器上振蕩解吸2 h，取上清液，測定龍血素A和龍血素B的含量，計算其解吸率。龍血素A和龍血素B的解吸率和乙醇濃度的關(guān)系見圖7?？梢姡?dāng)乙醇濃度逐漸升高時，龍血素A和龍血素B的解吸率均逐漸升高，而乙醇濃度為80%時解吸率達(dá)到最大值，當(dāng)乙醇濃度為90%時解吸率反而下降，可能由于乙醇濃度升高后洗脫性能增強(qiáng)，被洗脫下來的雜質(zhì)增多，導(dǎo)致解吸率降低。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇進(jìn)行洗脫較為適宜。

2.3.5? 洗脫體積考察

上樣吸附后，先用純化水洗去雜質(zhì)至流出液呈中性為止，然后用80%乙醇進(jìn)行洗脫，每10 mL接取1管洗脫液，測定龍血素A和龍血素B的含量，計算洗脫率，并繪制動態(tài)洗脫曲線。洗脫率（%）=洗脫液中龍血素A、B的含量÷上樣液中龍血素A、B的含量×100%。結(jié)果見圖8?？梢姡?0%乙醇洗脫曲線比較集中，當(dāng)乙醇體積為5 BV時基本能將龍血素A和龍血素B洗脫完全，洗脫率達(dá)92.35%，故選擇80%乙醇5 BV將龍血竭總黃酮洗脫下來。

2.3.6? 最佳工藝驗(yàn)證

按照優(yōu)化得到的最佳工藝對龍血竭總黃酮進(jìn)行純化分離：龍血竭乙酸乙酯提取物用0.3%NaOH溶解，上樣濃度為12 mg/mL，上樣量為2 BV，上樣體積流量為1.0 BV/h，依次用純化水洗脫雜質(zhì)至流出液呈中性為止，再用80%乙醇5 BV洗脫，洗脫液回收乙醇，濃縮至干，進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果見表4。龍血竭飲片龍血素A和龍血素B的總含量為1.03%，大孔樹脂經(jīng)D-101純化后的總黃酮中龍血素A和龍血素B的總含量為3.05%，為龍血竭飲片中含量近3倍。

3? 討論

本研究基于龍血竭總黃酮的抗炎鎮(zhèn)痛作用，擬對龍血竭總黃酮進(jìn)行提取純化，進(jìn)而制備醇脂質(zhì)體凝膠，用于壓瘡的治療。由于醇脂質(zhì)體的載藥量小，且龍血竭總黃酮水溶性不好，故需對龍血竭總黃酮進(jìn)行精制純化。本研究對龍血竭總黃酮的純化工藝進(jìn)行了研究，為后續(xù)進(jìn)行龍血竭總黃酮醇脂質(zhì)體凝膠的相關(guān)研究進(jìn)行原料準(zhǔn)備。

目前有文獻(xiàn)報道采用堿溶酸沉法提取龍血竭總黃酮[14]，但相關(guān)報道較少，所以本研究采用其他純化方法對龍血竭總黃酮的純化工藝進(jìn)行研究。大孔吸附樹脂法是目前能夠應(yīng)用于生產(chǎn)的純化方法之一，所以本研究選擇大孔樹脂對總黃酮進(jìn)行純化。

由于龍血竭中存在色素，在甲醇、乙醇溶液中顯紅色，用比色法測定總黃酮時顯色后溶液的顏色變化不明顯，采用比色法進(jìn)行總黃酮的含量測定存在干擾，測定結(jié)果不準(zhǔn)確，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，也未發(fā)現(xiàn)較合適的總黃酮測定方法，所以，本研究通過龍血素A和龍血素B的含量來表征龍血竭總黃酮的量。但由于龍血素A、B只是龍血竭總黃酮中的2個主要成分，以兩者的含量表征龍血竭總黃酮的量尚不夠準(zhǔn)確，還需要對龍血素A、B與總黃酮的含量關(guān)系進(jìn)行研究，才能更好地表征總黃酮的含量。

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（收稿日期：2018-12-17）

（修回日期：2019-01-16;編輯：陳靜）