HPLC-DAD法建立加味滋膵膠囊指紋圖譜研究

冉亞東，原歡歡，禹奇男，彭世陸，蔣燕霞，劉世琪，彭濤，秦少容，董自亮

(太極集團有限公司，重慶 408000)

滋膵飲出自清·張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》，由黃芪、生地黃、山藥、山萸肉、生豬胰子組成，具有滋補膵臟、益脾固腎之功效，主治消渴。加味滋膵飲為卿玉玲主任醫(yī)師在大量臨床實踐的基礎上，去方中豬胰子，加莪術、益母草、丹參、大黃而成。組方具有養(yǎng)陰益氣、活血通絡的功能，用于治療氣陰兩虛、血瘀所致消渴，癥見腰膝酸軟、口渴喜飲、神疲氣短、小便量多渾濁、舌質(zhì)暗淡、舌苔薄白、脈細無力、糖尿病腎病見上述癥狀者。本課題組將其開發(fā)成生物利用度高、順應性好、攜帶方便的現(xiàn)代制劑加味滋膵膠囊。

中藥指紋圖譜是評價含有多種組分中藥復方質(zhì)量的有效手段，具有專屬性、整體性和模糊性等特點，其優(yōu)點在于盡可能全面地反映復方中的化學成分及其相對比例，保證中藥及其制劑的穩(wěn)定性和可靠性，已得到國內(nèi)外普遍認可[1-2]。本文參考相關文獻[3-4]，通過HPLC-DAD 法首次建立加味滋膵膠囊的指紋圖譜，以期控制該復方制劑的質(zhì)量，為該復方制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器及試藥

Agilent 1100系列液相色譜儀(Agilent公司)，Agilent色譜工作站；BP211型分析天平；HDM調(diào)溫電熱套金壇市華峰儀器設備有限公司)；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芪、山茱萸、丹參、山藥等藥材均購自安徽亳州市場，經(jīng)太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司質(zhì)檢中心楊修齊研究員鑒定符合藥典要求。

乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其余均為分析純。馬錢苷對照品(批號111640-201507，質(zhì)量分數(shù)99.2%)，購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.01%甲酸水；流速：1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：27 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液制備

精密稱取加味滋膵膠囊0.25 g，以40 mL水復溶，用95%乙醇調(diào)整醇含量至75%，均勻攪拌，靜置6 h，離心(20 min，3 000 r·min-1)，用75%乙醇洗滌沉淀2次，離心(20 min，3 000 r·min-1)，合并上清，減壓濃縮除去乙醇，將得到的提取物冷凍干燥，得到加味滋膵膠囊指紋圖譜樣品。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取馬錢苷對照品適量，用甲醇溶解，配制成馬錢苷濃度為65 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 指紋圖譜專屬性檢測

精密稱定加味滋膵膠囊樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測樣品，記錄各樣品內(nèi)色譜峰、保留時間、峰面積。分別精密吸取空白溶劑、樣品溶液注入HPLC儀中，記錄色譜與各標示峰的光譜圖。實驗結果表明，在該條件下空白無干擾。詳見圖1、圖2。

圖1 空白溶劑指紋圖譜

圖2 樣品指紋圖譜及光譜識別

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性與分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積RSD值，結果見表2、表3，由表可知，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.92%，相對峰面積RSD均小于4.36%，精密度良好，表明儀器性能穩(wěn)定。

表2 指紋圖譜精密度相對保留時間結果

表3 指紋圖譜精密度相對峰面積結果

2.5.2 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.2”項下取供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性、分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積RSD值，見表4、表5，由表可知，相對保留時間RSD均小于0.47%，相對峰面積RSD均小于8.11%，表明該方法重復性良好。

表4 指紋圖譜重復性試驗結果

表5 指紋圖譜重復性相對峰面積結果

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.1”項下色譜條件，在0、4、5、12、16、20、24 h分別進樣，以重現(xiàn)性、分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰相對保留時間以及相對峰面積RSD，見表6、表7，結果顯示，相對保留時間RSD均小于0.82%，相對峰面積RSD均小于9.09%，可判斷樣品24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6 指紋圖譜穩(wěn)定性相對保留時間結果

表7 指紋圖譜穩(wěn)定性相對峰面積結果

2.6 指紋圖譜共有模式的建立及相似度分析

精密吸取18批加味滋膵膠囊樣品，按照“2.2”項下制備供試品溶液，取20 μL注入色譜儀，并記錄120 min內(nèi)的色譜圖。

采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件，生成共有模式的對照指紋圖譜(圖3)，不同批次樣品共有色譜峰13個。18批樣品的相似度在0.951～0.998之間(S1～S18相似度值分別為0.977、0.994、0.994、0.995、0.992、0.998、0.997、0.990、0.955、0.994、0.951、0.991、0.988、0.997、0.997、0.994、0.997、0.998)，相似度高，符合指紋圖譜相關要求。

圖3 18批加味滋膵膠囊樣品指紋圖譜疊加

3 討論

本實驗考察了190～400 nm全波長掃描、全波長掃描提取278 nm、278 nm單波長、全波長掃描提取210 nm、全波長掃描提取207 nm等5種掃描方式，結果從譜峰的分離度上看，278 nm單波長效果較佳，且在該波長下譜峰信息最豐富。故選擇278 nm單波長掃描方式。

本實驗考察乙腈-0.01%甲酸水；甲醇-0.01%磷酸水；乙腈-0.01%磷酸水；乙腈-水；乙腈-0.1%磷酸水5種不同的流動相,實驗結果顯示，加入酸可以優(yōu)化峰形，但隨著酸濃度的增加，色譜峰的分離度并沒有實質(zhì)性變化，乙腈-0.01%磷酸水和乙腈-0.01%甲酸水色譜圖無明顯差異，甲醇-0.01%磷酸水色譜峰較寬，且若想達到較好的分離效果，可能需要較長的分析時間。綜合上述分析，最終流動相選擇乙腈-0.01%甲酸水。

綜上所述，本試驗采用HPLC-DAD建立的加味滋膵膠囊指紋圖譜，共有峰的相對保留時間穩(wěn)定；方法學考察表明重復性、穩(wěn)定性好，精密度均符合要求；采用相似度軟件分析樣品，計算出的相似度較高。以上實驗結果表明本實驗建立的方法成熟，各樣品批間一致性較好，可用于加味滋膵膠囊的質(zhì)量控制。