醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)實驗方法優(yōu)化

汪艷杰，許國權(quán)，郭 瑞，胡志輝

(江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056)

電泳法是生物化學中非常重要的一項技術(shù)。醋酸纖維素薄膜電泳由于其微量、快速、簡便、分辨力高等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于血清蛋白、糖蛋白等生物大分子的分離與檢測。其中醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白實驗是采用醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳方法，醋酸纖維素是纖維素的羥基乙酰化所形成的纖維素醋酸酯，將其溶于有機溶劑(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹均勻的薄膜即為醋酸纖維素薄膜[1]。醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，具有以下優(yōu)點：對蛋白質(zhì)樣品的吸附極少，分離條帶清晰。由于醋酸纖維素薄膜親水性比濾紙小，薄膜中所容納的緩沖液也少，電泳時的電流是由樣品傳導(dǎo)的，分離速度快，所需時間短，一般60 min左右即可。染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，可以制成透明的干板，便于保存和定量分析。

用醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白的主要原理是：血清中的各種蛋白組分分子量不同，以及在同一緩沖體系下所帶凈電荷也存在差異(當?shù)鞍踪|(zhì)的pH大于等電點時，該蛋白質(zhì)帶負電荷，在電場中向正極移動[2])，在同一電場下其泳動速率就不同，從而使血清中的各種蛋白組分得以分離[3]。但是，在醋酸纖維素薄膜電泳實驗過程中，實驗步驟相對較多，受人為操作因素和環(huán)境因素影響較大，因此，需對實驗進行不斷改進和完善，從而提高實驗質(zhì)量和效率。

1 材料與方法

1.1 試劑、薄膜及電泳槽

1.1.1 試劑配制 染色液：氨基黑B：0.5 g，甲醇50 mL，冰醋酸10 mL，蒸餾水40 mL，混勻。漂洗液：95%乙醇45 mL，冰醋酸5 mL，水50 mL。透明液：無水乙醇∶冰醋酸=7∶3。健康人血清(新鮮，無溶血現(xiàn)象)。

1.1.2 醋酸纖維素薄膜準備 取2 cm×8 cm的薄膜條若干，將薄膜小心地放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使它漂浮在液面，用鑷子輕壓，使它全部浸入緩沖液內(nèi)，待膜完全浸透(約30 min)后待用。

圖1 實驗中所用的醋酸纖維素薄膜

1.1.3 制作“濾紙橋” 剪裁尺寸合適的濾紙條，雙層貼附在電泳槽的支架上，使濾紙條的一端與膜支架的前沿對齊，而另一端浸入電泳槽的緩沖液內(nèi)。此電泳槽中間為負極，兩端為正極。此外，一定要注意清除氣泡，使濾紙緊貼在膜支架上。見圖2。

圖2 實驗中所用的水平電泳槽及濾紙橋

1.2 點樣

用鑷子取出醋酸纖維素薄膜，夾在干凈的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，在膜的無光澤面上作好標記。把薄膜鋪在載玻片上(無光澤面朝上)，將蓋玻片在血清中輕輕劃一下(量薄薄一層最好)，再在膜條無光澤面的一端1.5～2 cm處輕輕地水平落下并迅速提起，即在膜條上點上細條狀的血清樣品。見圖3。

圖3 醋酸纖維素薄膜點樣位置

1.3 電泳

將已點樣的薄膜使無光澤面向下，貼于電泳槽支架的“濾紙橋”上，薄膜一定要繃直，中間不能塌陷，蓋上電泳槽蓋之后，平衡10 min。以薄膜每厘米長度電壓為10 V左右，薄膜每厘米寬的電流強度為 0.4～0.6 mA，通電時間為60 min。

1.4 染色

電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色10 min。

1.5 漂洗

將染色完畢的薄膜自染液中取出，自來水下沖洗除去多余的染色液后，直接放入漂洗液中，連續(xù)更換幾次漂洗液，直到薄膜背景幾乎無色為止。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機將薄膜吹干。

1.6 透明

將脫色吹干后的薄膜進入透明液中，浸泡2～3 min后，取出緊貼于潔凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明薄膜圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 點樣質(zhì)量控制

醋酸纖維素薄膜電泳實驗中，點樣非常關(guān)鍵，會直接影響電泳圖譜的好壞。經(jīng)過幾年的教學實踐，筆者對學生強調(diào)了幾點細節(jié)，可以提高學生電泳圖譜的成功率。主要有以下幾個方面：①點樣前薄膜要充分浸透緩沖液，筆者認為過夜浸泡更合適；②將薄膜夾在雙層濾紙中輕壓吸去表面的多余水分，一定要注意不要將薄膜水分吸至過干(薄膜發(fā)白)，從而影響薄膜對血清蛋白的吸收，標準是薄膜表面沒有明顯的液體，如果薄膜發(fā)白則重新取一張新的薄膜；③自制點樣器：有些教材使用的點樣器是蓋玻片，在實驗中蓋玻片點樣量較大，電泳圖譜效果不好。筆者選擇的點樣器是X光片裁制而成，邊緣清晰，厚度適中，點樣量適中，不能重復(fù)點樣，點樣結(jié)束后，點樣處形成一條粗細均勻的淡黃色直線。見圖4。

2.2 改善透明過程

用鑷子將薄膜取出，貼在容器壁上(燒杯壁或培養(yǎng)皿上等)，注意不可有氣泡，用吹風機稍吹干薄膜，用膠頭滴管淋洗薄膜，將每組20 mL透明液淋洗玩即可，再用吹風機將薄膜徹底吹干，此時薄膜透明，小心將薄膜自容器壁上取下，則成為可長期保存的血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜。

透明過程直接影響到電泳圖譜的好壞，故對學生強調(diào)以下幾點：將薄膜貼在平整的玻璃器皿表面，例如培養(yǎng)皿背面、燒杯外壁等等位置，注意薄膜與玻璃之間貼合緊密，無氣泡存在。用膠頭滴管將透明液滴在薄膜上，滴透明液的過程中易產(chǎn)生氣泡，故對學生強調(diào)，將玻璃器皿稍微傾斜，傾斜角度不要過大，將透明液滴在薄膜表面。當薄膜呈現(xiàn)膠狀時，停止滴加透明液，用吹風機熱風吹干即可。

2.3 電壓的影響

見圖5，相同的血清樣品在不同電壓條件下，醋酸纖維素薄膜電泳的圖譜有一定的差異，電壓110 V時，條帶清晰，電壓90 V時，條帶有些彌散。故在本實驗條件下，110 V電壓，電泳時間1 h，能夠得到更為清晰的條帶。

圖4 自制點樣器點樣效果

圖5 左側(cè)電壓110 V，右側(cè)電壓90 V

2.4 優(yōu)化后的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜

一般透明后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的5條區(qū)帶，從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。如圖5所示，筆者對實驗過程進行改進后，電泳圖譜條帶分離清晰，無拖尾現(xiàn)象，實驗結(jié)果較為理想。

從上之下依次為：清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白

3 實驗中經(jīng)常出現(xiàn)的錯誤結(jié)果及原因分析

3.1 條帶拖尾現(xiàn)象嚴重

見圖6，醋酸纖維素薄膜電泳圖譜條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，原因是血清樣品不是新鮮的，或者電泳時電流過大。

圖7 條帶拖尾的薄膜

3.2 條帶未分開

有的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜條帶未分開，但是其他同時進行的圖譜條帶正常分離，可能的原因是樣品量過多，或者醋酸纖維素薄膜上的水分未用濾紙吸干，或者在點樣完成后，樣品未完全被薄膜吸收而發(fā)生位移或者迅速擴散，濃度降低而導(dǎo)致區(qū)帶分散不集中[4]。

3.3 條帶斷裂不整齊

醋酸纖維素薄膜電泳圖譜可以出現(xiàn)5條帶，但是每條帶中間出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，如圖7所示，是因為血清樣品量較少，點樣不均勻。故用點樣器點樣前，要確保點樣器已經(jīng)清潔干凈，均勻沾取血清樣品，觀察點樣器邊緣的血清樣品是否均勻完整。在實驗正式開始前，讓學生不斷地練習正確點樣過程，點樣效果達到圖4的效果后，再正式點樣。否則會直接影響實驗的最終結(jié)果。

圖8 條帶斷裂

圖9 條帶歪斜

3.4 條帶歪斜

見圖8，醋酸纖維素薄膜電泳圖譜歪斜，不整齊，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是點樣時的點樣區(qū)歪斜，或者將薄膜放置在電泳槽中時放置歪斜。

要想取得醋酸纖維素薄膜電泳實驗的成功，對實驗的每一步都應(yīng)嚴格控制，尤其是點樣和透明環(huán)節(jié)的控制與熟練程度，是實驗成敗的重要條件?？刂坪眠@兩點，就會得到質(zhì)量合格的電泳圖譜，從而提高實驗效率。