紅松松塔提取物多聚苯丙素-多糖復(fù)合物誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡

安巍巍 唐雅莉 趙蓮花 楊 悅 王新玲

近年來，腫瘤的發(fā)病率明顯增高，而乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1-3]。在目前臨床中，局部的手術(shù)范圍日趨保守，化療、放療等綜合治療的有效性使得乳腺癌的長期生存率不斷提高，但總生存率仍然不理想。因此，進(jìn)一步研發(fā)乳腺癌的治療方法和開發(fā)新的治療方案仍然任重道遠(yuǎn)。

紅松(Pinus Koraiensis Sieb.et Zucc)為我國東北的鄉(xiāng)土樹種。由于紅松松塔沒有可以入藥的記載，國內(nèi)對紅松松塔還缺乏系統(tǒng)的藥理活性研究。國外的研究證明松塔提取物多聚苯丙素-多糖復(fù)合物(Polyphenylpropenoid-polysaccharide complex，PPC)可激活人體內(nèi)的免疫細(xì)胞，尤其是樹突狀細(xì)胞，發(fā)揮增強(qiáng)人體自身免疫力的作用[4-5]，而且在研究中發(fā)現(xiàn)不同種屬松塔的提取物均可發(fā)揮相似的作用。我們前期的研究也證明紅松松塔的提取物可抑制S180荷瘤小鼠的腫瘤生長[6]。本研究以乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對象，考察PPC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為PPC的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自黑龍江省腫瘤防治研究所；紅松松塔采自黑龍江省伊春市；MTT和Hoechst 33258購自碧云天生物公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；α-MEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Cell death detection kit購自美國Roche公司；Caspase-3 Colorimetric Assay和Caspase-9 Colorimetric Assay購自美國Millipore公司；Caspase-3多克隆抗兔抗體購自美國Cell signaling公司；Caspase-3抑制劑(z-DEVE-fmk)購自美國Calbiochem公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的養(yǎng)抗兔二抗購自碧云天生物公司。其他常用試劑均為分子生物學(xué)實驗適用級別試劑。

1.2 方法

1.2.1 紅松松塔PPC的制備 按文獻(xiàn)報道進(jìn)行制備。簡述如下：紅松松塔簡單分解后進(jìn)行清洗，干燥，粉碎。將粉末與0.1 m NaOH按固液比1∶5混合，加壓提取2 h，過濾除去固體粉末，濾液以10 000 rpm離心15 min，取上清，調(diào)節(jié)pH7.0，過濾除菌，PPC濃度以μg/mL表示。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中，在飽和濕度，溫度為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代。

1.2.3 MCF-7細(xì)胞生長抑制實驗[7]取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，以每孔100 μL接種于96孔板。接種的同時加入PPC終濃度50、100、150和200 μg/mL。然后在培養(yǎng)24、48、72和96 h后，使用MTT法測定吸光度值，計算生長抑制率(以0時間或未處理細(xì)胞作為對照)。

1.2.4 細(xì)胞核熒光染色[8]取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，使用PPC處理細(xì)胞后48 h，收集細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，用PBS洗2次，以100 μL 4%的多聚甲醛重懸細(xì)胞，4℃固定1 h，1000 rpm離心3 min，棄上清，用PBS洗1次。使用10 μL PBS重懸細(xì)胞，加入Hoechst 33258，終濃度167 μM，37℃孵育10 min后，置于載玻片上，封片，熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.5 DNA片段化分析測定細(xì)胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，使用PPC處理細(xì)胞后48 h，收集細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，用PBS洗2次，按文獻(xiàn)方法提取DNA[9]：加入100 μL細(xì)胞裂解液(10 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM EDTA pH 8.0，0.5%Triton X-100)4℃裂解30 min，25 000×g離心20 min，收集上清液。加入40 ng.L-1Nase A，37℃孵育1 h，再加入40 ng.L-1proteinase K，37℃孵育2 h，加入20 μL 5M NaCl和120 μL異丙醇，-20℃過夜。25 000×g離心20 min，收集沉淀，以Tris-EDTA緩沖液(pH7.5)溶解。提出的DNA用2%瓊脂糖凝膠在100 V下電泳1 h，以0.5 μg.mL-1溴化乙錠染色20 min，以蒸餾水洗10 min，使用凝膠自動成像拍照。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC處理細(xì)胞后24、48和72 h，按說明書所述進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.7 Caspase-3和Caspase-9酶活力檢測 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，在使用PPC(終濃度50、100和200 μg/mL)處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞。按試劑盒方法進(jìn)行酶活力檢測。

1.2.8 Caspase-3蛋白表達(dá)分析[10]取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個細(xì)胞/mL，在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC(終濃度50、100和200 μg/mL)處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，按常規(guī)方法裂解細(xì)胞，測定蛋白濃度，以30 μg蛋白上樣后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳，分離蛋白。轉(zhuǎn)移到NC膜后，封閉、加入一抗和二抗后，使用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光方法顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，不同時間重復(fù)測量資料的差異分析采用重復(fù)測量方差分析。采用t檢驗和方差分析比較連續(xù)性變量在各組中的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPC對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用

不同濃度的PPC處理細(xì)胞不同時間后使用MTT法檢測細(xì)胞抑制率。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示時間和濃度分組的交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.351)，說明時間因素的作用不隨著濃度分組的不同而不同。48 h處理時間的抑制率顯著高于24 h；不同濃度兩兩比較，除25 μg/mL與50 μg/mL濃度無差別外，其余比較均可見差別。使用不同濃度、不同時間的抑制率作圖，可見濃度100 μg/mL(不同時間)或時間48 h(不同濃度)的結(jié)果穩(wěn)定(圖1)。因此，本研究選擇48 h處理時間點及100 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 PPC誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

PPC(100 μg/mL)處理細(xì)胞后，使用細(xì)胞凋亡試劑盒檢測吸光度值。重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果顯示時間因素有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.75，P=0.014)；不同時間兩兩比較結(jié)果顯示，除48 h與72 h無統(tǒng)計學(xué)差異，其余均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，即吸光度(凋亡比例)隨時間延長而增加，說明PPC可誘導(dǎo)細(xì)胞時間依賴性凋亡(圖2A)；DNA Ladder結(jié)果可見典型的細(xì)胞凋亡后DNA斷裂形成的條帶(圖2B)；Hoechst 33258染色表明，正常細(xì)胞全部藍(lán)染，細(xì)胞壁完整(圖2C)，而PPC處理MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞核破碎后形成凋亡小體，即形成小的致密藍(lán)染(箭頭所示)，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型形態(tài)(圖2D)。

2.3 Caspase-3和Caspase-9酶活力增加

PPC(100 μg/mL)處理細(xì)胞48 h后，使用Caspase activity detection kit檢測Caspase-3和Caspase-9酶活力(n=3)。結(jié)果可見PPC處理后MCF-7細(xì)胞的Caspase-3和Caspase-9酶活力有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，可能是由于樣本量較小(圖3)。

2.4 Caspse-3前體酶蛋白表達(dá)減少

PPC(100 μg/mL)處理MCF-7細(xì)胞不同時間后，蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果可見Caspase-3前體酶的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，說明PPC處理后Caspase-3酶活化(圖4)。

圖1 PPC對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of PPC on proliferation of MCF-7 cells

圖3 PPC處理后細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的酶活力Figure 3 Activities of caspase-3 and-9 in MCF-7 cells treated with PPC

圖4 PPC處理后對Caspase-3前體酶蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of PPC on the expression of pro-caspase-3 protein in MCF-7 cells

圖2 PPC處理后MCF-7細(xì)胞生長抑制的作用模式(凋亡)Figure 2 Apoptosis of MCF-7 cells induced by PPCNote：A.Cell apoptosis was detected by a cell death detection kit；B.DNA fragmentation；C.Control cells；D.Nuclear staining with Hoechst33258(cells treated with 100 μg/mL of PPC for 48 h).

2.5 Caspse-3抑制劑部分抑制細(xì)胞凋亡

在有和無z-DEVE-fmk(20 μM)條件下使用PPC(100 μg/mL)處理MCF-7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡檢測可見細(xì)胞凋亡被部分抑制；蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果可見，PPC處理細(xì)胞Caspase-3前體酶的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而z-DEVE-fmk和PPC同時處理細(xì)胞時Caspase-3前體酶的蛋白表達(dá)恢復(fù)，進(jìn)一步證明PPC處理后Caspase-3酶的活化(圖5)。

圖5 Caspase-3抑制劑z-DEVE-fmk對PPC處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Caspase-3前體酶蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of caspase-3 inhibitor(z-DEVE-fmk)on PCC-induced apoptosis and expression of pro-caspase-3 protein in MCF-7 cellsNote：A.Cell apoptosis was detected by a cell death detection kit；B.The expression of pro-caspase-3 protein was detected by Western blot.Con.Control；1.z-DWVE-fmk；2.PPC；3.PPC+ z-DWVE-fmk；*P<0.05，compared with the control group.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和凋亡有關(guān)。隨著對細(xì)胞凋亡研究的深入，現(xiàn)已證明細(xì)胞凋亡受阻可能是腫瘤發(fā)病機(jī)制之一，這就使采用新的藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來治療這一疾病成為一種可行的辦法[11-13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身程序，由基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，具有獨特的形態(tài)和生化特征。

基于文獻(xiàn)報道和我們的研究結(jié)果，我們考察了PPC對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的細(xì)胞毒作用及其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，PPC可抑制MCF-7細(xì)胞的生長，且有濃度和時間依賴性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化是判斷細(xì)胞發(fā)生凋亡的最直觀方法[14]。Hoechst 33258熒光染色法顯示PPC處理的MCF-7細(xì)胞可見核濃縮的強(qiáng)藍(lán)色熒光團(tuán)塊及細(xì)胞皺縮、核碎裂、凋亡小體等凋亡形態(tài)學(xué)改變，而對照細(xì)胞則顯示為全部藍(lán)染。DNA ladder的形成與細(xì)胞凋亡密不可分，同時也是判斷細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[15]。PPC作用于MCF-7細(xì)胞后，在瓊脂糖凝膠電泳上產(chǎn)生核酸片段條帶。以上研究結(jié)果提示，PPC可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

盡管凋亡的分子機(jī)制還不完全清楚，但已認(rèn)識到凋亡過程受相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)和控制[16]。Caspase在細(xì)胞凋亡過程中起著主導(dǎo)作用[17]，其中，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，在細(xì)胞凋亡過程中居中心地位；而Caspase-9是線粒體凋亡途徑的重要“啟動者”[20]。本研究結(jié)果表明，PPC誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡時Caspase-3和Caspase-9的酶活力升高，Caspase-3前體酶蛋白表達(dá)下降，即表示Caspase-3酶發(fā)生活化，而且Caspase-3抑制劑z-DEVE-fmk可部分抑制PPC誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡，并可恢復(fù)Caspase-3前體酶蛋白表達(dá)。因此PPC可能通過激活Caspase家族誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果表明PPC可能具有潛在的乳腺癌治療作用，但仍需要對包括體內(nèi)抑瘤作用等方面進(jìn)一步研究。