基于贛南臍橙指紋圖譜的主成分及UPLC-Q-TOF-MS分析

祝愛(ài)艷 梁 露 侯金雪 李昱昊 孫雪峰 楊延峰 王遠(yuǎn)興

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，我國(guó)也是柑橘種植和產(chǎn)量大國(guó)之一[1]。贛南是中國(guó)臍橙主產(chǎn)區(qū)，贛南臍橙是屬于蕓香科、柑桔屬，特征為果頂有臍，像人的肚臍眼，故而得名，是江西省的一種名貴特產(chǎn)[2-3]。臍橙口感脆嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含黃酮類、檸檬苦素類等多種活性成分[4]。大量研究表明，臍橙中的生物活性成分具有抗氧化，預(yù)防癌癥，調(diào)節(jié)免疫力，抗過(guò)敏，抗衰老等多種生理活性[5-7]。指紋圖譜是實(shí)現(xiàn)鑒別真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大，特征性強(qiáng)，整體性和模糊性等特點(diǎn)，已在環(huán)境保護(hù)、食品評(píng)價(jià)、中藥質(zhì)量控制[8-10]等許多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。紅外光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法等方法均可生成指紋圖譜[11-17]。劉世堯[18]通過(guò)對(duì)奉節(jié)臍橙的指紋圖譜研究，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)，建立了有效的指紋圖譜，并說(shuō)明其具有偽冒果品鑒定的應(yīng)用價(jià)值。Wang 等[19]利用高效液相建立了龍葵的指紋圖譜，對(duì)其建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行質(zhì)量控制。主成分分析是一種多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，它是一種降維或者把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種方法[20]。唐會(huì)周等[21]通過(guò)主成分對(duì)市售臍橙的香氣成分進(jìn)行分析，得到影響臍橙品質(zhì)的香氣成分，表明臍橙香氣成分的主成分分析可作為臍橙香氣品質(zhì)的評(píng)價(jià)方法。張曉麗等[22]利用熒光結(jié)合主成分對(duì)橙汁進(jìn)行品質(zhì)鑒別，結(jié)果表明這兩種方法相結(jié)合可為橙汁品質(zhì)鑒別提供技術(shù)支持。超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)是復(fù)雜樣品中化學(xué)組成分析和鑒定的重要分析工具，能夠在缺少標(biāo)品的情況下對(duì)粗提物中微量成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、鑒定，具有高分辨率、高靈敏度、高選擇性、高質(zhì)量精度等優(yōu)點(diǎn)。

近年，隨著中國(guó)柑橘栽培面積的擴(kuò)大，區(qū)域特色植物贛南臍橙受到周邊產(chǎn)區(qū)偽冒果品的嚴(yán)重影響。以其自身品質(zhì)特征為基礎(chǔ)，建立有效的真?zhèn)舞b定與品質(zhì)評(píng)價(jià)方法，可樹立贛南臍橙品牌，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。本試驗(yàn)中采用高效液相建立贛南臍橙指紋圖譜，通過(guò)比較相似度、共有峰分析其譜圖間差異性，利用主成分探討贛南臍橙在產(chǎn)地的分類情況，并用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）定性分析共有峰成分，以期完善贛南臍橙質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，樹立贛南臍橙的品牌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用贛南臍橙采摘于瑞金、信豐和安遠(yuǎn)等贛南和非贛南各地，見(jiàn)表1。采用新鮮、無(wú)病蟲害的贛南臍橙，每個(gè)地區(qū)在不同地方采集6 個(gè)點(diǎn)。每組樣品選取6 個(gè)大小均勻、無(wú)損傷的去皮、去核的果實(shí)，將其可食部分打碎混勻，用于試驗(yàn)分析。

甲醇（色譜純），德國(guó)Merck 公司；甲酸（色譜純），ROE 公司；水，屈臣氏蒸餾水。

表1 贛南臍橙信息Table 1 The information of navel orange samples in Gannan

1.2 儀器與設(shè)備

AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，機(jī)械昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；Agilent1290高相液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器），美國(guó)Agilent 公司；Agilent6538 高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 （配有Agilent1290 高效液相色譜儀、Agilent Mass Hunter 數(shù)據(jù)處理軟件與電噴霧離子源），美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備 精確稱取1.00 g 贛南臍橙果肉勻漿，加入2 mL 蒸餾水超聲提取20 min，置于離心機(jī)中5 000 r/min 離心20 min，將收集的上清液用0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾，然后測(cè)定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent-C18 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A 和甲醇為流動(dòng)相B 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0～12min，3%～30% B；12～27 min，30%～78% B；27～32 min，78%～95% B；32～37 min，95%～3% B。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件 霧化氣壓力2.76×103Pa，干燥氣流速10.0 L/min，干燥氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4.0 kV，掃描方式為全掃正離子模式，掃描范圍（m/z）50～1 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A 版”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行比較，得到全面反映多個(gè)色譜圖特征的贛南臍橙的對(duì)照指紋圖譜，得到共有峰。將其共有峰中時(shí)間居中的峰作為參照峰，并以參照峰的峰面積為分母，各共有峰的峰面積為分子，求得其相對(duì)峰面積。利用SPSS22.0 軟件對(duì)共有峰進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) 按照樣品的制備方法隨機(jī)抽取同一批次的贛南臍橙制備樣液，1d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定液相色譜，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果表明：其色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值基本沒(méi)有變化，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≦0.39%，相對(duì)峰面積RSD≦2.39%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取同一批次的贛南臍橙樣品，按照制備方法平行制備6 份測(cè)試液，測(cè)定液相色譜，比較其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明：各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≦0.62%，相對(duì)峰面積RSD≦2.56%，重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的贛南臍橙制備的樣液，分別在制備后24 h 內(nèi)每隔4 h 進(jìn)樣1 次，測(cè)定液相色譜，比較色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積。結(jié)果表明：各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≦0.28%，相對(duì)峰面積RSD≦1.76%，表明所制備的樣液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜的構(gòu)建

2.2.1 指紋圖譜的建立 將S1-S14 贛南臍橙樣品按1.3.1 節(jié)方法制備樣液，在1.3.2 節(jié)色譜條件下測(cè)定，得到各產(chǎn)地贛南臍橙的HPLC 圖。對(duì)其HPLC 圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)處理，獲得其高效液相對(duì)照指紋圖譜R，并建立14批贛南臍橙的指紋圖譜，見(jiàn)圖1[橫坐標(biāo)為保留時(shí)間（min），縱坐標(biāo)為所獲信號(hào)（mV）]。

圖1 14 批贛南臍橙的指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 14 batches of navel orange samples in Gannan

2.2.2 共有峰和參比峰的確定 根據(jù)14 批贛南臍橙指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的匹配功能，確定21 個(gè)色譜峰作為特征成分，組成其指紋圖譜，在對(duì)照指紋圖譜上標(biāo)定21 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖2。保留時(shí)間17.655 min即19 號(hào)共有峰峰面積相對(duì)穩(wěn)定，保留時(shí)間均一致，分離度良好，故選為參照峰，以其峰面積為1，計(jì)算其它各峰的相對(duì)峰面積。各產(chǎn)地臍橙的共有峰保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表2。由表2可知，各成分的色譜峰的相對(duì)峰面積有較大差異，說(shuō)明其含量差別較大，可能是由于各產(chǎn)地贛南臍橙品種資源、生態(tài)環(huán)境、生長(zhǎng)年限、地域性等條件的影響。

2.2.3 相似度評(píng)價(jià) 相似度作為中藥指紋圖譜的評(píng)價(jià)參數(shù)，可以最大限度地避免主觀因素影響，以實(shí)現(xiàn)對(duì)指紋圖譜整體相似性的客觀評(píng)價(jià)。采用中藥色譜指紋圖譜相似評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以生成的對(duì)照指紋圖譜與其14 批樣品進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 贛南臍橙的指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of the fingerprint of Gannan navel orange samples

表2 贛南臍橙指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Table 2 The relative peak areas of the flngerprints of common peaks of navel orange samples in Gannan

表3 14 批贛南臍橙的指紋圖譜間的相似度Table 3 The similarity of flngerprints from 14 batches of navel orange in Gannan

兩個(gè)n 維模式矢量夾角余弦越大 （接近1），它們?cè)较嗨?。由?可知，14 批贛南臍橙樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度都在0.90 以上，表明所測(cè)樣品的組分具有很強(qiáng)的相似性，各組間成分較為一致。

2.3 贛南臍橙真?zhèn)蔚淖R(shí)別

實(shí)際應(yīng)用中，通常以相似度制定真?zhèn)舞b別標(biāo)準(zhǔn)，相似度低于該值的樣品可看作不合格的樣品，一般設(shè)置相似度0.8 為閾值。對(duì)樣品S15～S18 以同樣條件分析。以2.2 節(jié)建立的贛南臍橙紋圖譜為對(duì)照，利用中藥色譜指紋圖譜相似評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004.A）評(píng)價(jià)其相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)相似度系數(shù)將樣品分2 類：第1 類是編號(hào)S15、S16 的樣品，相似度系數(shù)大于0.8；編號(hào)S17、S18 的樣品為第2 類，相似度系數(shù)小于0.8。根據(jù)相似度結(jié)果判定S15、S16 號(hào)樣品為贛南臍橙，S17、S18 號(hào)樣品非贛南臍橙，與檢測(cè)樣品本身屬性完全吻合。結(jié)果表明，本研究建立的贛南臍橙指紋圖譜可以很好地鑒別贛南臍橙和非贛南臍橙，進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的贛南臍橙指紋圖譜的準(zhǔn)確性，說(shuō)明其具有鑒定偽冒果品的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 主成分分析結(jié)果

SPSS22.0 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對(duì)14 批不同產(chǎn)地贛南臍橙的21 個(gè)共有峰（變量）進(jìn)行主成分分析，見(jiàn)表4。主成分的數(shù)目不僅要滿足數(shù)據(jù)降維的目的，而且要盡可能綜合多的信息，一般累積方差貢獻(xiàn)率不低于80%。由表4可知，可取前4 個(gè)作為主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.75%，4 個(gè)主成分足以說(shuō)明該數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)。

表4 4 個(gè)主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues and cumulative contribution of 4 principal components

因子負(fù)荷反映各指標(biāo)對(duì)主成分貢獻(xiàn)的大小，因子負(fù)荷的符號(hào)指各指標(biāo)對(duì)改變主成分值的增減效果[23]。由表5可知，第1 主成分反映的指標(biāo)主要有共有峰1，2，3，10，14，7，18，其中共有峰1 和共有峰2 對(duì)第1 主成分較強(qiáng)的逆負(fù)荷，說(shuō)明其含量越高，第1 主成分值越少。共有峰3，10，14，17，18對(duì)第1 主成分有較強(qiáng)的正負(fù)荷，說(shuō)明其含量越高，第1 主成分值較大，而剩下的共有峰對(duì)第1 主成分影響較小。同理可得第2 主成分和第3 主成分的主要影響指標(biāo)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表篩選共有的特征成分，發(fā)現(xiàn)決定性作用的化學(xué)成分。本試驗(yàn)篩選出的特征成分未知，需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進(jìn)一步確定。

根據(jù)表2、表4和表5中2 的數(shù)據(jù)，以第1 主成分值為橫坐標(biāo)，第2 主成分值為縱坐標(biāo)，可得贛南臍橙在第1 和第2 主成分上的分布，還有21 個(gè)共有峰在第1 和第2 主成分上的分布，見(jiàn)圖3。

表5 旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表Table 5 Load matrixes of postrotational common factors after spinning

由圖3a 可知，每個(gè)點(diǎn)都由原21 維空間的樣本點(diǎn)降維映射而來(lái)，反映14 個(gè)樣品的分類情況。由圖中各樣點(diǎn)的位置大致可將其分為4 類：Ⅰ類包括S10，S13；Ⅱ類包括 S3、S8、S11；Ⅲ 類包括S2；其余的歸為Ⅳ類。瑞金的地理位置和其他地方較遠(yuǎn)，信豐、尋烏與剩下的地方相較遠(yuǎn)，而剩下的地方較為相近，在主成分的得分圖上可以反映地理位置對(duì)其影響。由此可得地理位置相近，其各個(gè)成分的含量較為一致。由圖3b 可知，各共有峰對(duì)第1 和第2 主成分的影響，也可判斷主成分的主要影響指標(biāo)。

圖3 贛南臍橙的主成分分析得分圖（a）和因子載荷圖（b）Fig.3 Score plot（a） and loading plot（b） from PCA of navel orange in Gannan

2.5 共有峰的鑒定結(jié)果

樣品經(jīng)1.3.1 節(jié)方法制備，在1.3.2 節(jié)色譜條件和1.3.3 節(jié)質(zhì)譜條件下測(cè)定，對(duì)其共有峰進(jìn)行鑒定，結(jié)合離子碎片和相關(guān)文獻(xiàn)，可推斷3 個(gè)共有峰的化合物，見(jiàn)表6。

表6 贛南臍橙共有峰的UPLC-ESI-QTOF-MS 數(shù)據(jù)Table 6 UPLC-ESI-QTOF-MS data of common peaks of navel orange samples in Gannan

共有峰13 母離子[M+H]+m/z 為581.1829，共有峰18 母離子[M+H]+m/z 為581.1828，它們的二級(jí)質(zhì)譜都有m/z 為273.0758 即[M+H-308]+碎片離子峰，為丟失了m/z 308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片離子。蕓香柚皮苷和柚皮苷為同分異構(gòu)體，相對(duì)分子質(zhì)量580，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[24]，[25]推斷：共有峰13 為蕓香柚皮苷，共有峰18 為柚皮苷。共有峰19母離子[M+H]+m/z 為611.1932，其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子峰m/z 為465.1385，449.1434，431.1332，303.0856，二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子峰中的303.0856 是其丟失了m/z 為308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片。根據(jù)文獻(xiàn)[26]推斷其可能為橙皮苷。

3 結(jié)論

利用高效液相譜建立了贛南臍橙不同產(chǎn)地臍橙的指紋圖譜，并對(duì)其化學(xué)模式進(jìn)行識(shí)別。結(jié)果表明，樣品的出峰數(shù)目、分離度均較理想，并標(biāo)定出21 個(gè)共有峰。通過(guò)其方法學(xué)考察和相似度計(jì)算，建立的指紋圖譜可較為全面地反映贛南臍橙的特征。同時(shí)準(zhǔn)確鑒定了贛南和非贛南臍橙，為贛南臍橙的質(zhì)量控制提供了參考。利用主成分分析，將共有峰成功實(shí)現(xiàn)降維。由PCA 載荷得分結(jié)果，看前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率85.75%，由主成分的得分圖可以將贛南臍橙根據(jù)產(chǎn)地分為4 類。利用UPLCQ-TOF-MS 鑒別共有峰，結(jié)合質(zhì)譜信息和相關(guān)文獻(xiàn)，推斷3 個(gè)共有峰化合物分別是蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷。

綜上所述，運(yùn)用指紋圖譜和主成分分析可實(shí)現(xiàn)快速分析，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，互相驗(yàn)證和補(bǔ)充，多角度綜合評(píng)判贛南臍橙的質(zhì)量。然而，對(duì)于共有峰未尚未全部鑒別。在今后的研究中，應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜對(duì)其它共有峰進(jìn)行鑒別。同時(shí)擴(kuò)大采樣范圍，加強(qiáng)研究的系統(tǒng)性和深入性，使研究結(jié)果更具實(shí)用價(jià)值。