傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中抑制嗜水氣單胞菌群體感應及生物膜形成乳酸菌的篩選與鑒定

林 洋 崔天琦 呂欣然，2 白鳳翎* 勵建榮 沈 琳

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 北京100083 3 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116101）

嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila）分布范圍廣，主要存在于土壤、淤泥、海水及淡水等環(huán)境中，是一種可以導致人-獸-水生動物共患病發(fā)生的革蘭氏陰性條件致病菌，也可引起鯉魚、金錢魚、黃鱔和中華鱉等多種水生動物出現(xiàn)敗血癥，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[1]。嗜水氣單胞菌致病性與之產(chǎn)生的溶血素、蛋白酶及粘附素（菌毛和表面S 層蛋白）等毒力因子密切相關[2]。其毒力因子間通過協(xié)同作用產(chǎn)生毒性效應且受細胞密度的調(diào)控，這種細胞密度依賴性調(diào)節(jié)被稱為群體感應（quorum sensing，QS）[3]。QS 感應之間的交流主要依靠信號分子的傳導，嗜水氣單胞菌的信號分子主要是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）[4]。同時，細菌QS 現(xiàn)象也是導致食品腐敗的主要方式之一，近年來已成為研究的熱點[5-6]。

細菌生物膜（bacterial biofilm，BF）的形成、生物發(fā)光、毒性基因表達和胞外多糖的合成等都與QS 密切相關[7]。BF 是細菌在生長過程中為適應外界生存環(huán)境形成的一種生長方式，形成生物膜的細菌具有極強的耐藥性[8-10]。如果利用傳統(tǒng)的抗生素來抑制BF 的形成，會導致細菌產(chǎn)生極強的耐藥性[11]?？蓮淖匀唤缰袑ふ疑镌葱匀后w感應抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI），通過降低細菌生物膜的形成，抑制細菌QS 的方式，控制食品中腐敗菌和致病菌的生長繁殖。

QSI 是只針對QS 系統(tǒng)具有抑制作用，而不干擾細菌體內(nèi)正常的生命活動[12]。QSI 一般通過抑制信號分子合成，降低其受體蛋白活性或抑制信號分子合成酶，促進信號分子的降解，與信號分子競爭性結(jié)合受體蛋白等4 種方式抑制細菌的群體感應[13-14]。目前已從動物、植物、微生物中獲得多種生物源性QSI[15]。其中，微生物源性QSI 主要來源于真菌和芽孢桿菌。Musthafa 等[16]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillus sp.SS4） 代謝產(chǎn)物對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）生物膜和胞外蛋白酶的抑制率分別為33%和65%。Nakayama 等[17]發(fā)現(xiàn)放線菌（Streptomyces sp.）Y33-1 的次生代謝物siamycin I 可有效抑制糞腸球菌（Enterococcus faecalis）QS 系統(tǒng)所需明膠酶的產(chǎn)生，而不影響菌體的生長。

乳酸菌廣泛分布于傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動物腸道及土壤淤泥等自然環(huán)境中，通過產(chǎn)生乳酸、雙乙酰、羅伊氏菌素以及乳酸菌素等方式抑制它種微生物的生長繁殖[18]。乳酸菌生物防腐制劑具有安全、高效、綠色、無殘留等特點，廣泛應用于食品的防腐保鮮中。而對乳酸菌的代謝產(chǎn)物能否作為腐敗菌和致病菌的QSI 方面的研究國內(nèi)外鮮見報道。Park 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）NR28 能夠有效抑制大腸肝菌（Escherichia coli）ATCC43894 生物膜的形成，具有QS 抑制活性。

本文以水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌嗜水氣單胞菌為目標菌株，以來源于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的乳酸菌為供試菌株，從供試菌株乳酸菌中篩選可作為QSI 的菌株，并分析其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，同時探究其對生物膜生成量和結(jié)構(gòu)的影響，為研發(fā)一種嗜水氣單胞菌QSI 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 乳酸菌菌株：AJS2-4（安徽績溪酸豆角）、AJX3-5 （安徽績溪腌雪菜）、LHJ1-5（遼寧葫蘆島腌芥菜）、LJS1-4（遼寧錦州酸菜）、LZH1-3（遼寧彰武酸黃瓜）、CY2-4（遼寧朝陽酸菜）、NNL1-5 （內(nèi)蒙古寧城酸辣椒） 和LDS513（遼寧大連酸黃瓜）。

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號分子，僅當外源AHLs 信號分子出現(xiàn)時，菌株才能夠產(chǎn)生紫色菌素，并檢測出環(huán)境中的信號分子C4-HSL～C8-HSL，保藏于本院微生物實驗室。

目標菌株：嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila）LY-2，分離自腐敗大菱鲆體表，保藏于本院微生物實驗室。

1.2 試劑、儀器與設備

1.2.1 培養(yǎng)基和試劑 LB 肉湯、LB 瓊脂、MRS 肉湯、MRS 瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白酶（2.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（2.0×105U/g）、中性蛋白酶（2.0×105U/g）、堿性蛋白酶（2.0×105U/g）、胃蛋白酶（1.5×105U/g），華藍化學有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、卡那霉素、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 儀器與設備 ABI stepone plus PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標儀，美國BIO-RAD；S-4800 掃描電鏡、E-1045 鍍金儀，日本日立公司；MM-80 顯微鏡，日本NIKON；DL-CJ-2N 超級潔凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國IKA 公司；5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Multiskan FC 酶標儀，美國Thermo Fisher 公司；V3 全自動菌落計數(shù)儀，杭州訊數(shù)科技有限公司；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco Free Zone 2.5 臺式真空冷凍干燥機，美國LABCONCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌無細胞上清液 （cell free supernatants，CFS） 和嗜水氣單胞菌AHLs 的制備 將分離自傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的乳酸菌接種于MRS 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，以2.0%的接種量傳代培養(yǎng)2 次。將發(fā)酵液于4 ℃6 500 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾獲得CFS，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將-80 ℃保存的嗜水氣單胞菌接種于LB 肉湯中，以1.0%的接種量傳代培養(yǎng)1 次，將發(fā)酵液于4 ℃6 500 r/min 離心15 min，收集的無細胞上清液中含有AHLs 信號分子，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑制嗜水氣單胞菌群體感應乳酸菌的篩選將-80 ℃保存的紫色桿菌CV026 接種于LB 肉湯，30 ℃過夜培養(yǎng)。以2%接入量接種于10 mL 含有10 μg/mL 卡那霉素的LB 肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，移取2.5 mL 菌液于25 mL 含有25 μL AHLs信號分子的LB 軟瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，倒入擺有牛津杯的素瓊脂的平板中，待凝固后取出牛津杯，每孔加入180 μL 乳酸菌CFS，置于30 ℃培養(yǎng)24 h，用全自動菌落計數(shù)儀記錄孔周圍呈現(xiàn)的白色不透明的渾濁圈。同時以MRS 為對照組。

1.3.3 乳酸菌粗提物的制備 取100 mL 乳酸菌CFS 于500 mL 分液漏斗中，加入20 mL 乙酸乙酯進行萃取。萃取5 次。加入溶劑后順時針緩慢震蕩，靜置5 min 后，收集合并上層及乳化層液體，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集萃取液于真空冷凍干燥，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?5 ℃下120 r/min 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無殘留的有機溶劑，收集萃取液，真空冷凍干燥，置-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 乳酸菌粗提物對紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長曲線的影響 將活化的嗜水氣單胞菌用LB 肉湯制成約106CFU/mL 菌懸液，將190 μL 菌懸液置于96 孔板中，加入10 μL QSI 粗提物，使其終質(zhì)量濃度分別達到32.0，16.0，8.0，4.0，2.0 mg/mL，以不加粗提物的LB 培養(yǎng)基作為對照，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 在波長595 nm 處測定OD 值。

1.3.5 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

1.3.5.1 96 孔板法測定對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率 利用96 孔板法[20]，將活化的嗜水氣單胞菌用LB 肉湯制成約106CFU/mL 菌懸液，移取180 μL 菌懸液于96 孔板中，加入20 μL 乳酸菌粗提物，同時以MRS 為對照組。30 ℃培養(yǎng)24 h后，緩慢移出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200 μL 無菌水清洗5 次后，再添加200 μL 0.4%的結(jié)晶紫染色5 min 后，用200 μL 無菌水清洗3 次，置于干燥箱中干燥10 min。取出96 孔板，向孔中加入200 μL 95%乙醇，并移取150 μL 液體于新的96 孔板內(nèi)，用酶標儀測其OD595nm。每個樣品設置3 個平行。

式中：ODcontrol——對照組OD 值；ODQSI——CFS處理組的OD 值。

1.3.5.2 光學顯微鏡觀察 在含有1.0 mL LB 肉湯的24 孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），再向孔中加入10 μL 過夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌菌懸液和100 μL 乳酸菌粗提物，同時以MRS 為對照組，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，用超純水將蓋玻片潤洗3 次，再用0.4%結(jié)晶紫染色20 min，通過顯微鏡觀察生物膜。

1.3.5.3 掃描電鏡分析 采用光學顯微鏡觀察乳酸菌粗提物對生物膜形成的影響。加入2.5%戊二醛溶液，置于4 ℃下固定12 h，用無菌水將蓋玻片洗滌3 次除掉殘留的戊二醛，然后分別用40%，70%，90%，100%乙醇脫水處理15 min，將蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察生物膜。

1.3.6 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌信號分子（AHLs）的降解 參照Romero 等[21]的方法稍作修改。將乳酸菌粗提物添加到1 mL 含有10 μL AHLs 信號分子粗提物的LB 肉湯中，使其終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL 和8.0 mg/mL，同時以MRS 為對照組，37 ℃培養(yǎng)24 h。采用牛津杯打孔法測定其降解活性。

1.3.7 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌QS 抑制作用的影響因素 參考呂欣然等[22]的方法并稍作修改，測定蛋白酶、溫度和pH 值對乳酸菌粗提物的影響。

1） 蛋白酶 將乳酸菌粗提物pH 值分別調(diào)至胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶的最適pH 值，將蛋白酶添加到粗提物溶液中使其最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃下水浴2 h，再將pH 值調(diào)為初始值。以未處理的乳酸菌粗提物為對照，采用牛津杯打孔法測定其活性。

2） 溫度 將乳酸菌粗提物分別在40，60，80，100 ℃和121 ℃條件下處理30 min，以未處理的乳酸菌粗提物為對照，采用牛津杯打孔法測定其活性。

3） pH 利用1.0 mol/L NaOH 和1.0 mol/L HCl 將粗提物溶液的pH 值分別調(diào)為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 和6.0，采用牛津杯打孔法測定其降活性。

1.3.8 乳酸菌菌株鑒定

1.3.8.1 生理生化鑒定 挑選具有群體感應抑制作用的乳酸菌菌株，參照東秀珠[23]、Bergey[24]和凌代文[25]等文獻對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定。

1.3.8.2 16S rRNA 鑒定 參考馬歡歡等[26]的方法并稍作修改。移取1.0 mL 乳酸菌菌懸液于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，利用DNA快速抽提試劑盒對菌株DNA 進行提取，以16S rDNA 通用引物對PCR 進行擴增。正向引物為27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技術公司合成。PCR 擴增反應體系：DNA 模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR 擴增擴增反應程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。使用1%瓊脂糖對PCR 產(chǎn)物進行電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物送到上海生物工程股份有限公司測定序列。將獲得的序列與NCBI 的GeneBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對和分析，然后應用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)平行3 次，結(jié)果用平均值±標準偏差表示，用軟件Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制嗜水氣單胞菌QS 作用乳酸菌的篩選

當外源AHLs 信號分子存在時，能夠誘導紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色素。當某種群體感應抑制劑存在時，其能夠抑制紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色素。本研究采用牛津杯打孔法共獲得8 株對嗜水氣單胞菌QS 有抑制作用的乳酸菌菌株。圖1顯示部分乳酸菌菌株對嗜水氣單胞菌QS 的抑制效果?？梢钥闯觯砑恿巳樗峋x物的孔周圍出現(xiàn)渾濁不透明的抑制圈。在8 株抑制QS 的乳酸菌中，菌株 AJS2-4（安徽績溪酸豆角）和 LZH1-3（遼寧省彰武酸黃瓜） 對嗜水氣單胞菌QS 抑制作用較強，抑菌圈直徑分別為13.81 mm 和12.25 mm（圖1），因此選擇菌株AJS2-4 做后續(xù)試驗。

圖1 乳酸菌菌株AJS2-4 和菌株LZH1-3 對紫色桿菌CV026 產(chǎn)紫色素的抑制效果Fig.1 Inhibtion effecs of LAB strain AJS2-4 and LZH1-3 on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 乳酸菌粗提物對紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長曲線的影響

為了驗證菌株AJS2-4 是通過影響嗜水氣單胞菌QS 系統(tǒng)而非抑菌的方式發(fā)揮作用，需研究菌株AJS2-4 粗提物對紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌生長曲線的影響。如圖2所示，乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為32 mg/mL 和16 mg/mL 時，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的生長被完全抑制；乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的OD 值分別降低0.46 和0.42；乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 和2 mg/mL 時，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的生長曲線與對照組的生長趨勢基本一致，說明菌株AJS2-4 粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 和2 mg/mL 時，其對紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 沒有抑菌活性。質(zhì)量濃度4 mg/mL的粗提物被應用于后續(xù)研究。

圖2 菌株AJS2-4 粗提物對紫色桿菌CV026 （a）和嗜水氣單胞菌LY-2 （b）生長曲線的影響Fig.2 Effect of LAB crude extraction from strain AJS2-4 on growth curves of C.violaceum CV026 （a）and A.hydrophila LY-2 （b）

2.3 乳酸菌粗提物對生物膜形成的影響

圖3 菌株AJS2-4 粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 生物膜形成的影響Fig.3 Effect of crude extraction from strain AJS2-4 on biofilm microscopic of A.hydrophila LY-2

96 孔板法結(jié)果表明，4 mg/mL 的菌株AJS2-4粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率為32.25%。圖3是菌株AJS2-4 粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜影響的光學顯微鏡圖片和掃描電鏡圖片?？梢钥闯?，采用光學顯微鏡觀察時，對照組嗜水氣單胞菌菌落濃密（圖3a），而經(jīng)菌株AJS2-4 粗提物處理的嗜水氣單胞菌菌落密度較稀疏（圖3b），表明菌株AJS2-4 粗提物可有效降低嗜水氣單胞菌生物膜的形成。應用掃描電鏡觀察時，對照組細菌緊密聚集形成完整的生物膜，結(jié)構(gòu)較致密（圖3c），而經(jīng)菌株AJS2-4 粗提物處理后，細菌已不能聚集形成片狀的生物膜，結(jié)構(gòu)稀薄疏松，細胞的完整性被破壞，表明菌株AJS2-4 粗提物不僅降低嗜水氣單胞菌生物膜的生成量，也能使其生物膜結(jié)構(gòu)破裂變得疏松（圖3d）。SUN 等[27]研究發(fā)現(xiàn)水萊茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）QSI02 提取物二酮哌嗪類化合物cyclo（Trp-Ser）質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時，對銅綠色假單胞菌PA01 生物膜抑制率達到59.9%，光鏡和掃描電鏡結(jié)果表明，二酮哌嗪類化合物cyclo （Trp-Ser） 使銅綠色假單胞菌PA01生物膜結(jié)構(gòu)疏松，與本研究結(jié)果相似。

2.4 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 信號分子的降解效果

當外源AHLs 信號分子存在時，誘導紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色菌素。圖4是菌株AJS2-4 粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 信號分子降解效果圖。與對照組相比，菌株AJS2-4 粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時，使紫色暈圈變小且降解率為49.36%；用質(zhì)量濃度為8 mg/mL 菌株AJS2-4 粗提物處理時，紫色暈圈完全消失，信號分子被完全降解。結(jié)果表明，菌株AJS2-4 粗提物對嗜水氣單胞菌信號分子存在降解作用，從而抑制嗜水氣單胞菌的QS 系統(tǒng)。Torres 等[28]將分離自貝類的南極超微細菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42 與C6-HSL（10mmoL/L）信號分子共培養(yǎng)時，對C6-HSL 信號分子的降解率高達99.7%，進而抑制地中?；【?VibC-Oc-097（V.mediterranei）的QS，與本研究結(jié)果相似。

圖4 菌株AJS2-4 粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 降解效果Fig.4 Effect of crude extraction from strain AJS2-4 on AHLs-degradation

2.5 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群體感應抑制作用的影響因素

圖5顯示菌株AJS2-4 粗提物對蛋白酶的敏感性。可以看出，菌株AJS2-4 粗提物經(jīng)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及胰蛋白酶處理2 h 后對嗜水氣單胞菌無QS 抑制活性，推測菌株AJS2-4 粗提物中對嗜水氣單胞菌QS有抑制活性的物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

表1是不同溫度和pH 處理對菌株AJS2-4粗提物的影響。可以看出，菌株AJS2-4 粗提物經(jīng)40，60，80，100 ℃和121 ℃處理30 min 后，抑制活性未發(fā)生顯著性改變，表明菌株AJS2-4 中的蛋白類活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。此外，菌株AJS2-4 粗提物抑制QS 活性物質(zhì)隨著pH 的升高呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，在pH 5.0 時，抑制QS 的活性物質(zhì)活性完全喪失，表明菌株AJS2-4 粗提物中具有QS 抑制作用的蛋白類活性物質(zhì)在酸性條件下活性較好，受環(huán)境pH 影響較大。

2.6 乳酸菌菌株鑒定

菌株AJS2-4 的生理生化鑒定結(jié)果見表2，依照文獻[24]、[25]可初步斷定菌株AJS2-4 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖5 蛋白酶對菌株AJS2-4 粗提物活性的影響Fig.5 Effect of protease on the activity of crude extraction from strain AJS2-4

表1 溫度和pH 處理對菌株AJS2-4 粗提物活性的影響Table 1 Effect of temperature and pH on crude extraction from strain AJS2-4

表2 菌株AJS2-4 的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain AJS2-4

圖6是菌株AJS2-4 的16S rRNA 基因擴增電泳圖，結(jié)果顯示菌株AJS2-4 核酸序列在1 400 bp 左右被成功擴增出一條特異性亮帶。將PCR 擴增產(chǎn)物進行測序后，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。由圖7可知，菌株AJS2-4 與植物乳桿菌（Lb.Plantarum）KF673529.1 在同一個分支上，置信度為99%。AJS2-4 被鑒定為植物乳桿菌（Lb.plantarum），該結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相同。

圖6 菌株AJS2-4 的16S rRNA 基因擴增電泳圖Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain AJS2-4

圖7 菌株AJS2-4 的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain AJS2-4

3 結(jié)論

從安徽績溪酸豆角中獲得1 株能夠抑制嗜水氣單胞菌QS 活性的乳酸菌菌株AJS2-4。該乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，并通過降解AHLs 信號分子的方式抑制嗜水氣單胞菌的QS 作用。初步分析菌株AJS2-4 粗提物中抑制QS 活性物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。通過生理生化試驗和16S rRNA 序列分析菌株AJS2-4，被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。本文從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中獲得微生物源性QSI，對挖掘新的乳酸菌生物資源以及研發(fā)高效的微生態(tài)制劑提供借鑒作用。