優(yōu)良抗氧化能力發(fā)酵乳桿菌P13的篩選及其耐逆特性

王 英 董月 夏秀東 李 瑩 周劍忠

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014）

乳酸菌與人類生活密切，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中廣泛存在，是公認(rèn)安全的食品級微生物。對乳酸菌的功能特性的研究結(jié)果顯示，其對人體具有多方面的保健功能，如提高免疫力，緩解乳糖不耐癥，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)抗過敏，降低膽固醇，抗炎，延緩衰老等[1-4]。乳酸菌已成為食品與藥物等相關(guān)產(chǎn)品的主要配料，用于生產(chǎn)功能性發(fā)酵食品、保健品或抗衰老藥品。

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress）是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)活性氧中間體的促氧化成分與機(jī)體內(nèi)的抗氧化成分之間的平衡被打破，為一種失調(diào)狀態(tài)[5]。研究表明，氧化應(yīng)激形成過程中伴隨產(chǎn)生自由基、活性氧、活性氮等活性分子，會以不同的機(jī)制作用于體內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)和核酸等生理活性及遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病變[6-10]。

大量關(guān)于乳酸菌體內(nèi)與體外的抗氧化功能試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，乳酸菌細(xì)胞和無細(xì)胞提取物在體外具有清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，螯合金屬離子等活性[11-13]。體內(nèi)攝入乳酸菌對機(jī)體或細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有顯著的調(diào)節(jié)作用，能提高體內(nèi)抗氧化相關(guān)功能基因的表達(dá)及降低體內(nèi)過氧化產(chǎn)物的水平[14-16]。

隨著生活水平的提高和保健意識的增強(qiáng)，具有抗氧化、提高免疫等相關(guān)功能的產(chǎn)品得到廣泛關(guān)注。本研究順應(yīng)目前對功能保健產(chǎn)品和功能乳酸菌的需求，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選與挖掘具有強(qiáng)抗氧化功能的乳酸菌，旨在為開發(fā)針對氧化-還原失衡和氧化應(yīng)激損傷的功能性產(chǎn)品提供可靠的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌株資源，具有重要的理論研究和實(shí)踐應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

樣品：沈陽地區(qū)農(nóng)戶家傳統(tǒng)酸菜和潮州泡菜。參考菌株：發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC53103，購美國菌種保藏中心。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）（Sigma-Aldrich），南京天為生物科技有限公司；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、鄰菲羅啉，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；PCR 用酶、核酸分離試劑、電泳相關(guān)試劑與材料，大連寶生物有限公司；QIAamp Stool Mini Kit 核酸提取試劑盒、核酸純化試劑盒，Qiagen 公司；過氧化氫，華東化學(xué)試劑（無錫）公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、抗壞血酸、N-（乙酰氨基）亞氨基二乙酸二鈉鹽及其它化學(xué)試劑均為分析純級，南京卓越生物工程有限公司。

儀器與設(shè)備：BioRad MyCycler 梯度PCR 儀，南京潤亞生物科技發(fā)展有限公司；GIS3500 凝膠成像儀，上海培清科技有限公司；UV-1600PC 紫外分光光度計，上海美普達(dá)科技有限公司；YS100尼康生物顯微鏡，南京新興光學(xué)儀器有限公司；124S-CW 分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YQX-11 厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1C 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SIGMA3K-15 臺式冷凍離心機(jī)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；TOMY SX500 自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology 公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離 利用MRS 和LEE 兩種培養(yǎng)基分離發(fā)酵蔬菜中的乳酸桿菌 （Lactobacillus）菌株和乳酸球菌（Lactococcus）菌株。

取1 mL 發(fā)酵蔬菜汁加入9 mL 無菌生理鹽水中，充分混勻后，依次用無菌生理鹽水梯度稀釋，分別為10-2，10-3，10-4，10-5，10-65 個梯度，各取后3 個稀釋梯度的稀釋菌液100 μL 涂布于MRS和Lee 培養(yǎng)基平板上，分別將平板倒置于厭氧培養(yǎng)箱和生化培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。厭氧條件為N2（85%）、CO2（5%）、H2（10%）。

培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等特征盡可能多地挑取單菌落，對獲得的純菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)，初步篩選出乳酸菌。將分離獲得的乳酸菌連續(xù)傳代5 次以上，篩選出生長狀態(tài)穩(wěn)定且生長速度較快的菌株，37 ℃條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期，保存20%的甘油液體中，在-80 ℃的超低溫冰箱中保存，待用。

1.2.2 乳酸菌無菌生理鹽水菌懸液制備 將分離的乳酸菌單菌落接種于3 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)18～20 h。以此培養(yǎng)液為接種液，按照2%的接種量接種于50 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)18 h，獲得菌株的培養(yǎng)液。4 ℃，10 000 r/min 離心6 min，收集菌體，無菌生理鹽水洗滌2 次后重懸菌體，調(diào)整菌體密度為（1.01±0.05）×109CFU/mL，待用。

1.3 體外抗氧化特性測定

1.3.1 乳酸菌分離物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基 （DPPH·）能力的測定 乳酸菌活細(xì)胞對DPPH·清除能力的測定參照文獻(xiàn)[17]方法并略有修改，具體操作如下：取2 mL 待測乳酸菌的生理鹽水懸浮液，加入2 mL DPPH·溶液 （用無水乙醇溶解配制DPPH，終濃度為0.4 mmol/L），混合均勻，然后置室溫遮光反應(yīng)30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清，在波長517 nm 處測定樣品的吸光度A對照，測3 次平行值。對照組樣品以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。清除率按公式（1）計算。

式中：A對照——對照組吸光度；A樣品——樣品組吸光度。

1.3.2 乳酸菌分離物還原活性的測定 還原活性分析參照文獻(xiàn)[18]方法并略有修改，具體操作步驟如下：取0.5 mL 乳酸菌的細(xì)胞生理鹽水懸浮液，加到1.5 mL PBS 溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）中，并加入1.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，此混合液于50 ℃水浴保溫20min，冰水中迅速冷卻至室溫，再向此混合液中加入1.5 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，充分混勻后，8 000 r/min 離心10 min 去除蛋白等沉淀物質(zhì)，取2 mL 上清液，向其中加入2 mL 生理鹽水，同時加入1 mL 0.1% FeCL3溶液，充分震蕩使其混合均勻，靜置孵育10 min 后在波長700 nm處測定反應(yīng)體系的吸光值。其結(jié)果采用L-半胱氨酸作標(biāo)準(zhǔn)物來表述乳酸菌的還原力。

分別配制不同濃度（0～400 μmol/L）的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述步驟進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測定結(jié)果，L-半胱氨酸鹽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，Y=0.0008x-0.0088，R2=9952。

1.3.3 乳酸菌抗油脂過氧化能力的測定 利用硫代巴比妥酸（TBA）法方法測量脂質(zhì)過氧化作用。亞油酸乳狀液的制備：將0.1 mL 亞油酸，0.2 mL吐溫20 加入19.7 mL 去離子水中，0.5 mL 磷酸鹽緩沖溶液 （0.02 mol/L，pH 7.4），1 mL 亞麻油酸乳狀液，0.2 mL FeSO4（0.01%），0.02 mL 抗壞血酸鹽（0.01%）和0.4 mL 乳酸菌生理鹽水懸浮液充分混合，37 ℃孵育12 h。將2 mL 上述反應(yīng)液，0.2 mL 三氯乙酸（TCA，4%），2 mL 硫代巴比妥酸（TBA，0.8%），0.2 mL 二叔丁基對甲酚（BHT，0.4%）充分混合，于100 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后冰上降溫，加入2 mL 丁醇進(jìn)行提取。在532 nm 處測定提取液的吸光值。按照公式（2）計算各菌株的抑制亞油酸過氧化率。

1.3.4 乳酸菌清除羥自由基（OH·）能力的測定利用Fenton 反應(yīng)體系測定菌液的OH·清除能力，具體方法參照文獻(xiàn)[19]并稍作修改，具體操作如下：將1 mL 亮綠（0.435 mmol/L），2 mL 硫酸亞鐵（0.5 mmol/L）1.5 mL H2O2（3.0%），1 mL 乳酸菌生理鹽水菌懸液混勻后于37 ℃水浴30 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清，于波長525 nm 處測吸光度，空白以蒸餾水代替試樣。OH·清除率計算公式：

1.4 具有高抗氧化能力菌株P(guān)13 的耐逆特性測定

1.4.1 菌株耐酸能力測定 菌株耐酸能力測定方法參照[6]進(jìn)行，并稍作修改。具體方法如下：分別挑取P13 和ATCC53103 的單菌落，在無菌條件下接種于3 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h，按照2%的接種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，離心收集菌體（4 ℃，10 000×g，5 min），用PBS（pH 7.2）緩沖液洗滌兩次，然后用PBS 重懸細(xì)胞，調(diào)整菌體密度為1.01×108CFU/mL，用HCl 調(diào)pH 值至2.5，37 ℃靜置，分別于0，0.5，1，2，3 h 時取樣，樣品梯度稀釋后，涂布于MRS 平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，計算菌株的存活數(shù)量。以lg（CFU/mL）表示菌體的數(shù)量。

1.4.2 菌株耐膽鹽能力測定 菌株的耐膽鹽能力測定方法參照[6]進(jìn)行并稍作修改稍作修改，具體方法如下：分別挑取P13 和ATCC53103 的單菌落在無菌條件下接種于3 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h，按照2%的接種量接種于50 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)18 h，離心收集菌體 （4 ℃，10 000×g，5 min），用PBS（pH 7.2）緩沖液洗滌2 次，然后用含有1 mg/mL 的胰酶和0.5%膽鹽的PBS（pH 8.0）緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整菌體密度為1.01×108CFU/mL，37 ℃靜置，分別于0，0.5，1，2，3 h 時取樣，樣品梯度稀釋后，涂布于MRS 平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，計算菌株的存活數(shù)量。以lg（CFU/mL）表示菌體的數(shù)量。

1.4.3 菌株耐過氧化氫能力測定 菌株的耐H2O2能力的方法參照文獻(xiàn)[7]、[8]進(jìn)行并稍作修改，具體方法如下：分別挑取P13 和ATCC53103 的單菌落，無菌條件下接種于3 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h，按照2%的接種量接種于50 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，離心收集菌體（4 ℃，10 000×g，5 min），菌體重懸于含有0.8 mmol/L H2O2的生理鹽水中，使菌體密度保持在1.01×108CFU/mL。37 ℃，每隔1 h取樣，樣品梯度稀釋后，涂布于MRS 平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，計算菌株的存活數(shù)量。以lg（CFU/mL）表示菌體的數(shù)量。

1.4.4 菌株耐鹽性能測定 在配制的MRS 液體培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的NaCl 固體，使其質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10 g/100 mL 和12 g/100 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后，冷卻至37 ℃以下備用。分別挑取P13 和ATCC53103 的單菌落，無菌條件下接種于3 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)16～18 h，將活化后的菌液接種到上述MRS 培養(yǎng)基中，保持相同的初始密度 （1.01±0.01）×107CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，樣品梯度稀釋后，涂布于MRS 平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，計算菌株的存活數(shù)量。以lg（CFU/mL）表示菌體的數(shù)量。

1.4.5 菌株溶血特性測定 菌株的溶血特性試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，稍作修改。具體方法如下：分別挑取新鮮培養(yǎng)的P13 和ATCC53103 的單菌落，在無菌條件下劃線接種于含有7%羊血的血平板上，以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為對照，其中金黃色葡萄球菌為β-型，表皮葡萄球菌為γ-型。37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察溶血圈，菌落周圍沒有明顯變化，其溶血型為γ-型，參照表皮葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。在菌落周圍有明顯的溶血圈的為β-型，參照金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象；菌落周圍呈現(xiàn)墨綠色為α-型。

1.5 乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rDNA 遺傳學(xué)鑒定的方法參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

重復(fù)試驗(yàn)3 次，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0 和One-Way（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離

利用MRS 和LEE 2 種培養(yǎng)基，從東北酸菜和潮州泡菜中分離出59 種單菌落，經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接5次培養(yǎng)，生長穩(wěn)定且長勢良好的菌株有33 株。根據(jù)革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)結(jié)果，初步分離出29株乳酸菌，其中從東北酸菜中分離出16 株，編號分別為S1-1 至S1-16；從潮州泡菜中分離出13株菌，編號分別為P1 至P13。用尼康顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，分離獲得的29 株乳酸菌中，僅有4 株球菌，其余都是桿狀菌株，且短桿菌占主要優(yōu)勢。

2.2 分離菌株的DPPH 清除能力

Li 等[14]利用體外測定清除·OH.和DPPH·能力的方法對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 的抗氧化能力的研究顯示，植物乳桿菌C88 具有最高的·OH 和DPPH·的清除能力，清除率分別為44.31%和53.05%。Das 等[15]利用體外測定清除·OH 和DPPH·能力的方法對植物乳桿菌 DM5 的體外抗氧能力的研究顯示，在菌體密度為1010CFU/mL 時，DPPH·清除率達(dá)到55%，羥自由基的清除率為49%。本研究中初步分離獲得29 株乳酸菌，在相同條件下培養(yǎng)相同時間，獲得細(xì)胞的無菌生理鹽水的懸浮液，菌體密度控制為（1.01±0.05）×109CFU/mL。各菌株的清除DPPH·能力見表1。初步分離的乳酸菌菌株都有清除DPPH·的能力，且不同菌株之間清除DPPH自由基的能力存在顯著差異，29 株菌的DPPH 自由基清除率在10.81%～73.02%之間。有5 株菌的DPPH 自由基的清除率高于參照菌株，編號分別為S1-13、P1、P4、P10、P13，其中P13 的DPPH·的清除率大于70%。

表1 分離菌株的DPPH·清除能力Table 1 Scavenging rates of DPPH of isolated strains

2.3 分離菌株的·OH 清除能力

各分離菌株的·OH 清除能力見表2，可以看出，初步分離的乳酸菌菌株都有·OH 清除能力，而不同菌株之間的·OH 清除能力有顯著差異，29 株菌的·OH 清除率在8.13%～59.02%之間，P4 和P13 的·OH 清除率高于參照菌株。

2.4 分離菌株的還原活性

Amanatidou 等[21]用該方法對幾株米酒乳桿菌（Lactobacillus sake）的還原活性進(jìn)行測定，該研究結(jié)果顯示各菌株間的還原活性存在很大差異，8株菌的還原活性范圍在2.7～77.9 μmol/L L-半胱氨酸之間。本研究中的各分離菌株的還原活性見表3，可以看出，初步分離的菌株都具有還原活性，而不同菌株之間的還原活性差異顯著，還原活性在34.84～284.02 μmol/L L-半胱氨酸之間。有2株菌的還原活性高于參照菌株，編號分別為S1-13 和P13。采用相同的方法，不同乳酸菌的還原活性差異很大，這可能是由于菌體的生長時期不同其還原活性也不同。另外，菌體的處理方法也會導(dǎo)致菌株之間還原活性的差異。在益生菌株的篩選過程中，應(yīng)選擇公認(rèn)的具有益生功能的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株。

表2 分離菌株的·OH 清除率Table 2 Scavenging rates of ·OH of isolated strains

表3 分離菌株的還原活性Table 3 Reducing activities of isolated strains

2.5 分離菌株的抗脂質(zhì)過氧化活性

各菌株的抗脂質(zhì)過氧化活性見表4，可以看出，不同菌株的抗脂質(zhì)過氧化活性差異顯著，具有最高活性的菌株P(guān)13，其脂質(zhì)過氧化抑制率達(dá)68.88%，抗脂質(zhì)過氧化活性最低的菌株是S1-3，其脂質(zhì)過氧化抑制率僅為3.13%。與參照菌株ATCC53103 的抗脂質(zhì)過氧化活性相比，只有P13的抗脂質(zhì)過氧化活性高于ATCC53103。綜合體外4 項(xiàng)抗氧化指標(biāo)的測定結(jié)果，選擇P13 菌株為后續(xù)試驗(yàn)的研究對象。

2.6 菌株P(guān)13 和ATCC53103 的耐酸性能

正常情況下人的胃酸pH 值3.5～0.9。剛吃完飯后胃酸被稀釋到3.5；飯后3 h，胃酸的pH 值降到2.0 以下。作為益生菌，必須能夠耐受人體胃中的酸性環(huán)境。對菌株P(guān)13 的耐酸性能進(jìn)行測定（圖1）。隨著在酸性條件下保存時間的延長，菌體密度都呈下降趨勢，而P13 對酸的耐受能力高于對照菌株，在pH2 的條件下保存3 h，菌體密度仍能達(dá)到7.85×107CFU/mL。本研究結(jié)果與許多前人[14-15]研究結(jié)果一致。一般來說，來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品、人體或動物的乳酸桿菌具有較強(qiáng)的耐酸能力（2.5～4.0）。

表4 分離菌株的抗脂質(zhì)過氧化活性Table 4 Inhibition of lipid peroxidation of isolated strains

2.7 菌株P(guān)13 和ATCC53103 的耐膽鹽性能

對膽鹽（Bile salt）的耐受能力也是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)之一。人體小腸中膽鹽的質(zhì)量濃度在0.03～0.30 g/100 mL 范圍內(nèi)波動，益生菌要在小腸中發(fā)揮益生調(diào)節(jié)功能，必須耐受一定濃度的膽鹽作用[16]。本研究對菌株P(guān)13 和ATCC53103在模擬腸液中不同時間的菌體的存活率進(jìn)行統(tǒng)計（圖2），結(jié)果顯示：隨著時間的延長，菌株的存活率呈現(xiàn)下降趨勢。菌株不同，對膽鹽的耐受能力呈現(xiàn)差異，P13 對膽鹽的耐受能力顯著高于對照菌株（P＜0.05），在腸液中保存6 h 后，活菌數(shù)為2.84×106CFU/mL。

圖1 P13 和ATCC53103 的耐酸性能Fig.1 The acid resistance of P13 and ATCC53103

圖2 P13 和ATCC53103 的耐膽鹽性能Fig.2 The bile salts resistance of P13 and ATCC53103

2.8 菌株P(guān)13 和ATCC53103 的耐H2O2 能力

H2O2雖然是一種相對較弱的氧化劑，但是H2O2具有普遍存在性和長效性，對細(xì)胞具有直接的氧化損傷，或者作為羥自由基的前體；羥自由基相對于H2O2的活性弱，然而具有更高的氧化損傷能力[18-19]。本研究測定P13 和ATCC53103 在0.8 mmol/L H2O2的生理鹽水中不同時間菌體的存活量，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。在相同的H2O2濃度下處理6 h，ATCC53103 的活菌數(shù)量為4.41×107CFU/mL，P13 的活菌數(shù)量只有3.69×104CFU/mL，下降4 個數(shù)量級。

2.9 菌株P(guān)13 和ATCC53103 的耐滲透壓能力

Machado 等[22]研究表明乳酸菌在高滲的條件下，菌株的疏水性和膽鹽敏感性升高。根據(jù)Forsyth等[23]的研究，滲透壓力和熱壓力是導(dǎo)致細(xì)胞損傷和活力喪失的兩個重要因素。Fong 等[24]認(rèn)為滲透壓是細(xì)胞生長和發(fā)酵的重要限制因子。Desmond等[25]對Lactococcus lactis NZ9800 和L.paracasei NFBC 338 的耐滲透壓能力的研究結(jié)果顯示，在NaCl 含量29%溶液中放置1 h，菌體密度下降了一個數(shù)量級。Ferrando 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)3 株L.plantarum 在NaCl 含量為8%的條件下不能生長，且不同的菌株具有不同的耐滲透壓機(jī)制。本研究考察了不同NaCl 含量對 P13 和ATCC53103生長的影響，進(jìn)而判定菌株對NaCl 不同水平的耐受情況，結(jié)果見圖4。NaCl 含量在0～6%的范圍，P13 和ATCC53103 菌體的密度沒有明顯差異（P＞0.05），當(dāng)NaCl 水平超過6%時，呈現(xiàn)一定的抑制作用?？傮w來說，P13 的耐NaCl 能力高于ATCC53103菌株，在NaCl 含量為10%時，菌體仍然能夠保持生長，菌體密度為2.24×107CFU/mL（接種初始密度為1.01×107CFU/mL），生長受到嚴(yán)重抑制。從耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果來看，P13 具有良好的耐鹽特性，在鹽量高的食品發(fā)酵加工產(chǎn)業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

圖3 P13 和ATCC53103 的耐過氧化氫性能Fig.3 The H2O2 resistance of P13 and ATCC53103

圖4 P13 和ATCC53103 的耐NaCl 能力Fig.4 The NaCl resistance of P13 和ATCC53103

2.10 菌株P(guān)13 和ATCC53103 的溶血特性

沒有溶血活性和抗生素抗性的乳酸菌被認(rèn)為是安全的[27]。本研究對P13 和ATCC53103 的溶血活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，P13 和ATCC53103都是γ-型，不具有溶血活性，P13 可作為益生菌在食品加工中安全使用。

2.11 菌株P(guān)13 的鑒定

2.11.1 菌株的形態(tài)特性 菌株P(guān)13 在MRS 平板上培養(yǎng)48 h，菌落成乳白色，表面凸起，濕潤，菌落形態(tài)比較規(guī)則，呈圓形，直徑約1.2～1.5 mm，菌體呈典型桿狀，且常鏈狀排列，菌體（0.5～0.8）×（2.1～3.5）μm。

2.11.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析 以P13 的總DNA為模板，以16S 通用引物擴(kuò)增出目的條帶，PCR 產(chǎn)物純化后送上海生物工程有限公司測序。將獲得序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其與發(fā)酵乳桿菌的相似度最高，達(dá)99%。系統(tǒng)分析結(jié)果見圖5。P13 與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）自然聚集一枝，相似性高達(dá)99%。根據(jù)國際系統(tǒng)細(xì)菌委員會規(guī)定，16S rDNA 序列差異低于1%～1.5%的細(xì)菌屬于同一種。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，把P13 鑒定為發(fā)酵乳桿菌 （Lactobacillus fermentum）。

3 結(jié)論

采用體外抗氧化能力篩選的方法對分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌的抗氧化活性進(jìn)行測定，以鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC53103 為對照菌株，對分離出的目標(biāo)菌株進(jìn)行抗逆性測定，結(jié)論如下：

1） 綜合4 種體外抗氧化能力測定結(jié)果，確定P13 菌株為具有高效抗氧化能力的菌株，經(jīng)菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育分析，P13 被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

圖5 菌株P(guān)13 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of P13

2）與對照菌株鼠李糖乳桿菌GG ATCC53103相比，P13 具有較強(qiáng)的耐逆特性，其耐酸、耐膽鹽和耐滲透壓能力高于對照菌株，而P13 對H2O2的耐性低于對照菌株。

3） 菌株P(guān)13 和對照菌株鼠李糖乳桿菌GG ATCC53103 的溶血型都是γ-型，不具有溶血活性。