沙棘粕提取物對H2O2誘導(dǎo)的B16F10細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)及修復(fù)

張佳嬋 王昌濤* 易思雨 王蘊涵 趙 丹 孫寶國

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京100048 2 北京工商大學(xué)理學(xué)院 植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室 北京100048 3 北京工商大學(xué)食品學(xué)院 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京100048）

氧化應(yīng)激是機(jī)體不可避免的一種狀態(tài)，機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下會產(chǎn)生自由基，同時也會激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)來清除自由基，如抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶 （Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等。正常情況下機(jī)體內(nèi)氧自由基的生成和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)氧化損傷在體內(nèi)的聚集程度超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)自身的清除能力時，致氧自由基大量生成，引起脂質(zhì)過氧化、DNA 氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常[1-3]。近年來人們專注于對天然抗氧化活性成分的發(fā)掘和作用機(jī)制的研究，如高麗參提取物[4]、海帶酶解物[5]、蔓越莓提取物[6]、大蒜提取物[7]等能直接清除自由基，提高抗氧化酶的活性以及降低過氧化產(chǎn)物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，發(fā)揮防護(hù)氧化應(yīng)激損傷的作用。

沙棘是西北地區(qū)特有的高原特色水果。沙棘粕是沙棘籽經(jīng)過脫油處理后的副產(chǎn)物，前期研究證實沙棘粕提取物（SBSE）中富含豐富的黃酮、多酚、原花青素等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗衰老功能[8-10]。前期研究僅限于化學(xué)水平清除自由基或?qū)?xì)胞的直接刺激方面，未針對氧化損傷進(jìn)一步探究。SBSE 干預(yù)氧化應(yīng)激損傷的作用時期是在防護(hù)階段還是在修復(fù)階段不得而知。本試驗針對防護(hù)與修復(fù)兩個階段對SBSE 進(jìn)行研究。首先建立H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型，利用流式細(xì)胞術(shù)對模型細(xì)胞進(jìn)行評價；其次，為探討SBSE 對氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，本課題組利用H2O2刺激經(jīng)SBSE 預(yù)處理的B16F10 細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力及細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系含量和MDA 的積累水平；為探討SBSE 對氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)作用，用一系列SBSE 處理氧化應(yīng)激損傷模型，檢測細(xì)胞活力及細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT 和MDA 的水平。本課題組旨在研究SBSE 對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用，并初步分析其可能機(jī)制，為SBSE 的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘粕，青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰咎峁?，均烘干、粉碎、過篩；胰酶（1∶250），美國Sigma Aldrich 公司；DMEM 培養(yǎng)基、新生牛血清、PBS、1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素，美國GIBCO生命技術(shù)公司。Annexin V-PE/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，美國BD 醫(yī)療器械有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

B16F10 細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 儀器與設(shè)備

BS2202S 型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Elx-808 型酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek 公司；T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；流式細(xì)胞儀FACS Calibur，應(yīng)用CellQuest 軟件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA），美國BD 公司；DSHZ-300 恒溫水浴振蕩器，江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠；2-16N 型醫(yī)用高速離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；YJ-2450 醫(yī)用超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；CO2培養(yǎng)箱，Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE 的制備及初步分離 SBSE 的制備及初步分離方法參照文獻(xiàn)[9]，最終獲得試驗用SBSE。經(jīng)測定，10 mg/mL SBSE 溶液中黃酮含量為（2.97±0.31） mg/mL，總酚含量為（4.71±0.21） mg/mL，原花青素含量為（5.67±0.17）mg/mL。

1.3.2 H2O2誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞損傷模型的建立取對數(shù)生長期B16F10 細(xì)胞以0.05%胰酶消化、細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，5 000 個細(xì)胞。過夜后每孔加入100 μL 含不同濃度樣品的培養(yǎng)液或空白對照組培養(yǎng)液。試驗設(shè)置調(diào)零組、細(xì)胞對照組、試驗組。試驗組H2O2的培養(yǎng)質(zhì)量濃度均設(shè)定為15 ～1 500 μg/mL，每組至少6 個平行孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h。用常規(guī)方法加入5 mg/mL MTT溶液與DMEM 混合溶液（體積比1∶5）100 μL 處理4 h，150 μL DMSO 溶解，37 ℃孵育10 min，測定波長490 nm 處的吸光度值。

細(xì)胞活力=（試驗組-調(diào)零組）/（細(xì)胞對照組-調(diào)零組）×100%

選取IC50值為細(xì)胞損傷模型建立條件。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞損傷模型的評價 收集300 μg/mL H2O2處理1，4 h 和6 h 后的細(xì)胞樣本，每個樣品均獲取10 000 個細(xì)胞。利用Annexin VPE 和7-AAD 對細(xì)胞樣本進(jìn)行染色處理，應(yīng)用CellQuest 軟件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的獲取和分析。以Annexin V-PE 和7-AAD 熒光作雙參數(shù)點圖，細(xì)胞分為4 個區(qū)，即Q1：機(jī)械損傷細(xì)胞（Annexin V-PE-/7-AAD+）；Q2：凋亡晚期或壞死細(xì)胞（Annexin V-PE+/7-AAD+）；Q3：早期凋亡細(xì)胞 （Annexin V-PE+/7-AAD-）；Q4：活細(xì)胞（Annexin V-PE-/7-AAD-）。計算4 群細(xì)胞比例并分別對不同處理組進(jìn)行比較。

1.3.4 MTT 法測定SBSE 對人皮膚成纖維細(xì)胞活力的影響 利用MTT 法檢測不同濃度SBSE 對B16F10 細(xì)胞生命活力的影響。試驗組SBSE 的培養(yǎng)質(zhì)量濃度設(shè)定為5.00，1.00，0.50，0.10，0.05 mg/mL，每組至少6 個平行孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。其它步驟同1.3.2 節(jié)。

1.3.5 SBSE 對H2O2誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用 一定濃度的SBSE 作用B16F10細(xì)胞24 h，用PBS 清洗2 次，繼續(xù)用一定濃度的H2O2處理細(xì)胞4 h，利用MTT 法檢測細(xì)胞活力，探討SBSE 對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。建立H2O2誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞損傷模型，用一系列濃度的SBSE繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，通過MTT 法檢測細(xì)胞活力，探討SBSE 對細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。

1.3.6 SBSE 對B16F10 細(xì)胞GSH-Px、CAT、SOD及MDA 含量的影響 用300 μg/mL H2O2處理細(xì)胞4 h，建立H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，隨后用0，0.10 mg/mL 或0.40 mg/mL SBSE 繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，PBS 清洗，收集細(xì)胞。以不經(jīng)SBSE 處理的細(xì)胞為模型對照。

分別用0，0.10 mg/mL 或0.40 mg/mLSBSE 處理細(xì)胞24 h，隨后用300 μg/mL H2O2處理細(xì)胞4 h，PBS 清洗，收集細(xì)胞。以不經(jīng)H2O2處理的細(xì)胞為SBSE 對照。

細(xì)胞GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 含量的測定分別按照GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所得結(jié)果以±s 表示。本試驗均設(shè)3 組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 B16F10 細(xì)胞損傷模型的建立及評價

過氧化氫容易在細(xì)胞核組織中擴(kuò)散，導(dǎo)致各種氧化應(yīng)激產(chǎn)生，因此，在許多研究中都采用外源性過氧化氫處理細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷和凋亡的產(chǎn)生，從而研究生物活性物質(zhì)的細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)作用[11]。

圖1 H2O2 質(zhì)量濃度對B16F10 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of concentration of H2O2 on cell viability of B16F10 cells

本試驗建立了H2O2誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞損傷模型。首先，利用MTT 法檢測不同濃度H2O2對B16F10 細(xì)胞的損傷能力。通過探討1 500～15 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍H2O2對B16F10 細(xì)胞的活力的影響發(fā)現(xiàn)：300 μg/mL H2O2溶液對B16F10 細(xì)胞的致?lián)p率為（50.31±2.53）%。隨著濃度的減少，細(xì)胞活力越來越高，當(dāng)H2O2溶液質(zhì)量濃度低于150 μg/mL 時，對細(xì)胞活力影響不顯著（P＞0.05）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測300 μg/mL H2O2不同處理時間對B16F10 細(xì)胞凋亡情況的影響（圖2）。磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-PE 是一種標(biāo)記有熒光素的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）有很強的親和力，可特異性與PS 結(jié)合。正?；罴?xì)胞帶負(fù)電的PS 定位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡早期，由于細(xì)胞膜失去對稱性，PS 從胞膜的內(nèi)側(cè)暴露于胞膜外，因此被Annexin V-PE結(jié)合稱為識別凋亡細(xì)胞的標(biāo)志。壞死細(xì)胞PS 也顯露于外表使Annexin V-PE 結(jié)合成陽性，必須增加7-AAD 參數(shù)才能區(qū)分壞死細(xì)胞。凋亡早期細(xì)胞仍保持膜的完整性，7-AAD 不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而凋亡晚期和發(fā)生繼發(fā)壞死的細(xì)胞可同時被Annexin V-PE 和7-AAD 著色[12-13]。本試驗中采用的雙標(biāo)記方法可以將凋亡細(xì)胞與繼發(fā)壞死的細(xì)胞區(qū)分開，并能計算出陽性細(xì)胞百分率。對細(xì)胞樣本做3 次平行處理，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果統(tǒng)計見表1。300 μg/mL H2O2處理B16F10 細(xì)胞后，活細(xì)胞百分比隨著處理時間的延長而顯著降低（P＜0.01）。處理4 h 后，活細(xì)胞百分比為（49.77±2.74）%；當(dāng)處理延長到6 h 時，活細(xì)胞百分比降低至（28.65±3.15）%。早期凋亡細(xì)胞在處理1 h 后未見明顯增加，隨著處理時間的延長，由對照組的（1.97 ±0.34）%上升到 （17.91 ± 3.55）%（4 h，P＜0.01）和（18.22±0.64）%（6 h，P＜0.01）。此外，H2O2處理也誘導(dǎo)晚期凋亡的發(fā)生，處理4 h 后，由對照組的（4.31±0.55）%升至（21.24±2.61）%。繼續(xù)延長處理時間到6 h，晚期凋亡率達(dá)（61.41 ± 1.01）%，約為對照組的14.25 倍。

2.2 SBSE 對H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

圖2 H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞的凋亡情況Fig.2 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells

表1 H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞凋亡的作用（±s，%）Table 1 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells （±s，%）

表1 H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞凋亡的作用（±s，%）Table 1 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells （±s，%）

注：與對照組比較，“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

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細(xì)胞發(fā)生氧化損傷會誘發(fā)眾多功能性的損失，進(jìn)而引發(fā)組織和機(jī)體的衰老及病變。發(fā)掘具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的物質(zhì)的研究工作越來越得到人們的重視。為探討SBSE 對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，本課題組首先利用一系列SBSE 處理B16F10 細(xì)胞，隨后用300 μg/mL H2O2處理4 h，通過檢測細(xì)胞活力，分析SBSE 是否對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。選擇SBSE 的質(zhì)量濃度范圍為0.05～0.40 mg/mL，由圖3A 可知，SBSE 單獨處理細(xì)胞的活力均在60%以上；盡管SBSE 與H2O2雙重處理的細(xì)胞活力均有所降低，與模型組相比，H2O2誘導(dǎo)0.10 mg/mL SBSE 處理后的B16F10 細(xì)胞，其活力還是顯著提高（P＜0.01）；SBSE 低于或高于該濃度未表現(xiàn)出對細(xì)胞的保護(hù)作用，其中，當(dāng)SBSE 質(zhì)量濃度過高（0.40 mg/mL）時，反而不利于細(xì)胞抵抗H2O2的損傷。以0.10 mg/mL SBSE 處理細(xì)胞后，繼續(xù)進(jìn)行H2O2處理，細(xì)胞活力變化見圖3B。與單獨SBSE 處理組相比，兩種質(zhì)量濃度H2O2處理（150 μg/mL、300 μg/mL）均使細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；然而與單獨H2O2處理組（DMEM）相比，SBSE 處理均顯著增加細(xì)胞活力（P＜0.01，P＜0.01）。

圖3 SBSE 保護(hù)B16F10 細(xì)胞免受H2O2 誘導(dǎo)的氧化損傷Fig.3 The effects of SBSE to protect B16F10 cells away from H2O2-induced oxidative damage

2.3 SBSE 對H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞損傷模型的修復(fù)作用

諸多外因或內(nèi)因會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，在一定程度的氧化應(yīng)激會幫助機(jī)體清除老化細(xì)胞，控制或清理變異細(xì)胞；當(dāng)氧化應(yīng)激水平過高時，會產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致細(xì)胞或機(jī)體受到進(jìn)一步的損傷。當(dāng)損傷已然發(fā)生，若發(fā)掘出某些物質(zhì)可以干預(yù)氧化損傷的繼續(xù)傷害，減緩或消除對細(xì)胞核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的破壞，這將具有重要的研究意義。

圖4 SBSE 對H2O2 誘導(dǎo)B16F10 氧化損傷模型的修復(fù)作用Fig.4 The repair effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage model

本課題組利用一系列濃度SBSE 分別處理H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型，探討SBSE 對細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用。由圖4可知，單獨H2O2處理（模型組）后細(xì)胞活力為（52.03±8.97）%，在本課題考察SBSE 的濃度范圍。0.10 mg/mL SBSE 對損傷細(xì)胞具有微弱的修復(fù)作用，細(xì)胞活力提高至（56.48±2.32）%（P＜0.05）。

2.4 SBSE 對B16F10 細(xì) 胞GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 含量的影響

細(xì)胞的氧化應(yīng)激伴隨著細(xì)胞的生長和代謝，機(jī)體代謝產(chǎn)生的H2O2只有被不斷分解才能維持機(jī)體的正常運行。細(xì)胞損傷會導(dǎo)致其消除H2O2的能力下降，使活性氧自由基聚集，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，過氧化產(chǎn)物MDA 大量積累，繼而損害蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子。為了維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)，抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮著非常重要的作用?？寡趸窯SH-Px 和CAT 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，能夠分解機(jī)體代謝產(chǎn)生的過氧化氫。SOD 是機(jī)體主要的氧自由基（ROS）清除劑，能夠清除機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS 等自由基。

本課題探討了不同處理條件下B16F10 細(xì)胞的MDA 水平，以及抗氧化酶GSH-Px、CAT、SOD的含量（表2）。由表2可知：與空白對照組相比，0.10 mg/mL SBSE 對照組的GSH-Px 和 SOD 活力無顯著變化（P＞0.05），而CAT 水平呈降低趨勢（P＜0.05）；增大SBSE 處理濃度（0.40 mg/mL SBSE對照組） 后，GSH-Px、CAT 和SOD 含量均顯著降低 （P＜0.01）；SBSE 處理細(xì)胞 （0.10 mg/mL SBSE對照組和0.40 mg/mL SBSE 對照組） 后的MDA水平與空白對照組相比，無顯著變化（P＞0.05）。

此外，模型組的抗氧化酶GSH-Px、CAT 和SOD 水平顯著低于空白對照組（P＜0.01），MDA 含量顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型會導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化酶水平的降低以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的積累。由表2可知，一定濃度SBSE 的后處理可以增加損傷細(xì)胞抗氧化酶的活力，降低MDA 水平的積累。0.10 mg/mL SBSE 處理模型（H2O2-0.10 mg/mL SBSE 處理組）后，GSH-Px、CAT 和SOD 抗氧化酶活力顯著高于模型組，分別提高至 （303.06±19.24）mU/mg 蛋白、（107.95±1.29）U/mg 蛋白和（237.27±21.98）U/mg 蛋白；MDA 水平也由模型組的 （14.55 ±0.83）μmol/g 蛋白降為（8.12±0.96）μmol/g 蛋白。0.40 mg/mL SBSE 處理模型細(xì)胞的GSH-Px、CAT和SOD 活力隨著SBSE 處理濃度的增加而呈降低趨勢，MDA 水平高于H2O2-0.10 mg/mL SBSE 處理組。此外，0.10 mg/mL SBSE 的預(yù)處理也有助于保護(hù)B16F10 細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷，與模型組相比，SBSE 提高了細(xì)胞的抗氧化酶活力，細(xì)胞內(nèi)MDA 的積累也逐漸降低，由（14.55±0.83）μmol/g 蛋白顯著降至（11.46±0.92）μmol/g 蛋白（P＜0.05）。

表2 SBSE 對H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞損傷的修復(fù)和保護(hù)作用（±s，%）Table 2 The repair and protect effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage cells（±s，%）

表2 SBSE 對H2O2 誘導(dǎo)B16F10 細(xì)胞損傷的修復(fù)和保護(hù)作用（±s，%）Table 2 The repair and protect effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage cells（±s，%）

注：H2O2-0.10 mg/mL SBSE 處理組和H2O2-0.40 mg/mL SBSE 處理組表示H2O2 誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，隨后用0.10 mg/mL SBSE 或0.40 mg/mL SBSE 處理，觀察細(xì)胞各項指標(biāo)的變化；0.10 mg/mL SBSE-H2O2 處理組和0.40 mg/mL SBSE-H2O2 處理組表示0.10 mg/mL SBSE 或0.40 mg/mL SBSE 對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，隨后用H2O2 誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，觀察細(xì)胞各項指標(biāo)的變化；與空白對照組比較，“#”表示P＜0.05；“##”表示P＜0.01；與模型組比較，“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

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3 討論

目前，研究抗氧化應(yīng)激損傷的實驗主要有動物實驗法、化學(xué)測定法和細(xì)胞模型法等[14-16]?；瘜W(xué)測定法常用的有DPPH 自由基清除法、羥自由基清除法、ABTS 法等。前期研究證實SBSE 具有顯著的清除DPPH 和羥自由基的能力[10]?；瘜W(xué)測定法雖然快速、簡便，但難以模擬機(jī)體的復(fù)雜內(nèi)部環(huán)境，無法反映抗氧化劑的真實抗氧化機(jī)制。細(xì)胞模型法更接近于機(jī)體內(nèi)部的復(fù)雜環(huán)境，更貼切反映抗氧化劑在機(jī)體內(nèi)部的抗氧化機(jī)制。不僅如此，細(xì)胞實驗周期短，更能快速、高效地得出結(jié)果。B16F10 細(xì)胞為小鼠黑色素瘤細(xì)胞，具有增殖快、易于培養(yǎng)等特點，常被用作細(xì)胞模型[17-20]。氧化損傷模型主要有H2O2、叔丁基過氧化氫（t-BHP）、D-半乳糖等模型[21-23]。H2O2具有易于取得、操作簡便、造模周期短等特點而得到廣泛應(yīng)用[24-26]。

本文通過MTT 法建立了H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型，確定了H2O2的作用條件為300 μg/mL 刺激4 h，并利用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞損傷模型進(jìn)行評價。為探索SBSE 對氧化損傷模型的保護(hù)作用，研究了SBSE 的預(yù)處理在防御H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.10 mg/mL SBSE 的預(yù)處理有助于防御H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷，并且，細(xì)胞活力隨著H2O2處理條件的降低而呈現(xiàn)上升趨勢。為探討SBSE 對損傷模型是否具有修復(fù)作用，研究了SBSE 對細(xì)胞模型的影響，在考察濃度范圍，0.20 mg/mL SBSE 對損傷細(xì)胞具有微弱的修復(fù)作用，細(xì)胞活力提高至（58.19±4.32）%（P＜0.05）。

為進(jìn)一步明確SBSE 對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)機(jī)制，探究了細(xì)胞部分抗氧化酶系統(tǒng)以及過氧化產(chǎn)物MDA 積累的情況。在正常情況下，機(jī)體氧化與抗氧化處于動態(tài)平衡，機(jī)體自身的抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px 等在清除自由基方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)外界刺激導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，使機(jī)體代謝紊亂，無法維持起初的平衡狀態(tài)時，脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物。MDA 是目前公認(rèn)能反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的間接指標(biāo)，其含量變化不但可以反映氧自由基生成量及氧化反應(yīng)的強烈程度，還可反映其對組織損傷的嚴(yán)重程度[27]。張慧蕓等[28]在研究丁香多酚的細(xì)胞抗氧化水平時發(fā)現(xiàn)，丁香多酚可以通過提高SOD、CAT 和GSH-Px 的活力，降低MDA 含量來達(dá)到修復(fù)受損人肝細(xì)胞RBL 的作用。李華[29]在研究蟲草多糖的過程中發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖處理用8-甲氧補骨脂素聯(lián)合紫外線（8-MOP/UVA）制備的皮膚成纖維細(xì)胞氧化模型后，能夠顯著降低自由基含量，且線粒體跨膜電位的破壞程度也有所改善，自由基清除酶系（SOD、CAT 和GSH-Px）活力得到促進(jìn)。

本試驗結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷會導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化酶水平的降低以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的積累；一定濃度SBSE 的后處理可以增加損傷細(xì)胞抗氧化酶的活力，以及降低MDA 水平的積累；SBSE 的預(yù)處理也有助于提高細(xì)胞的抗氧化酶水平，過氧化產(chǎn)物MDA 的積累也逐漸降低?？梢詳喽⊿BSE 發(fā)揮保護(hù)及修復(fù)氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制是通過增加抗氧化酶活力，降低MDA 的積累來實現(xiàn)的。