ABCA1基因-565C/T基因變異與冠狀動脈狹窄程度的關(guān)系

至今已發(fā)現(xiàn)90多個與疾病相關(guān)的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter 1， ABCA1)基因變異位點(diǎn)，這些單核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)分布在編碼區(qū)和非編碼區(qū)(包括啟動子區(qū)也就是基因調(diào)控區(qū))，位于基因調(diào)控區(qū)(啟動子)序列中的單核苷酸多態(tài)性則會影響基因表達(dá)量，對人體有重大影響，也是目前基因組研究的一個熱點(diǎn)。因此本課題重點(diǎn)研究基因調(diào)控區(qū)(啟動子區(qū))-565C/T基因單核苷酸多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)人群中的分布和差異，分析其與冠心病易感性及與血脂的關(guān)系，并通過冠狀動脈造影檢查探討-565C/T基因多態(tài)性與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，通過確定ABCA1多基因核苷酸序列多變異差異與表型、疾病風(fēng)險和冠狀動脈病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，解釋內(nèi)蒙古地區(qū)個體對冠心病遺傳易感性和疾病嚴(yán)重程度的差異，分析對藥物耐受性和不同環(huán)境因素的反應(yīng)差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 冠心病組為2009年1月—2015年12月在我院心內(nèi)科行冠狀動脈造影陽性(至少1支冠狀動脈狹窄≥50%)病人141例，對照組204例為經(jīng)冠狀動脈造影排除冠心病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能不全、血液病、結(jié)核、腫瘤、大動脈炎等疾病。通過問卷訪談收集研究對象的基礎(chǔ)資料、既往史、家族史、吸煙史等。吸煙史的標(biāo)準(zhǔn)為過去1年或1年以上每天吸煙10支以上。所有研究對象均未服用調(diào)脂相關(guān)藥物。

冠狀動脈三支動脈為左前降支、左回旋支和右冠狀動脈，根據(jù)動脈粥樣硬化受累支數(shù)分為單支、雙支和多支病變，其中左主干受累定義為雙支病變，雙支以上病變?yōu)槎嘀Р∽?。本研究分為單支病變組、雙支病變組和多支病變組。根據(jù)美國心臟學(xué)院/美國心臟病學(xué)會(ACC/AHA)的PTCA指南按照冠狀動脈病變特征分為A型病變、B型病變和C型病變3種。A型病變指冠狀動脈病變范圍為孤立性短病變(長度<10 mm)、無或輕度鈣化、同心性、非完全閉塞、容易到達(dá)、非開口部、管壁光滑、未累積大分支、無血栓、非成角病變(<45°)；B型病變指冠狀動脈病變?yōu)楣軤瞠M窄(10～20 mm)、中重度鈣化、偏心性、完全閉塞(<3個月)、近端血管中度彎曲、開口部病變、管壁不光滑、需要導(dǎo)絲保護(hù)的分叉病變、冠狀動脈內(nèi)血栓、成角病變(>45°，<90°)；C型病變指冠狀動脈病變?yōu)閺浡?長度>20 mm)、不能保護(hù)的大分支、近端血管彎曲、易碎的脆性退化靜脈橋病變、完全閉塞(>3個月)、重度成角病變(>90°)。

1．2 方法

1.2.1 血脂水平的檢測 所有化驗檢查均采用次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，分離血清測定血脂水平，三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)以氧化酶法測定，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用PEG變構(gòu)酶法測定，試劑均為Leadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS AU 600全自動生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3 mL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照血?細(xì)胞-組織基因組DNA提取試劑盒的說明提取血液DNA。

1.2.3 設(shè)計PCR引物 -565C/T基因的上下游引物分別是5′GGCTTTGACCGATAGTAACCT 3′和5′CTCTTTCTCCTACCCCTTGAC 3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系50 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 2.0 μL，上游和下游引物分別為1.0 μL，滅菌超純水21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化 取PCR產(chǎn)物4 μL，分別加入內(nèi)切酶AciI 1 μL和10×Buffer 2 μL，加入滅菌超純水14 μL，37 ℃水浴酶切16 h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并確定樣品基因型，DNA Marker為BioMarkerⅠ。內(nèi)切酶AciI、BsmA I和10×buffer由美國BioLabs公司提供。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組和對照組基線資料比較 對冠心病組和對照組的基因型分布進(jìn)行平衡檢驗，χ2檢驗表明ABCA1基因-565C/T各4種基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡遺傳定律，具有群體代表性。詳見表1。

表1 冠心病組和對照組基線資料比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05

2.2 -565C/T各基因型和等位基因分布頻率及血脂比較 冠心病組-565C/T各基因型及其等位基因與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。冠心病組-565C/T CC、TC、TT 3種基因型HDL-C、LDL-C、TG、TC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表2 冠心病組和對照組-565C/T位點(diǎn)各基因型及等位基因頻率分布比較 例(%)

表3 冠心病組-565C/T 3種基因與血脂指標(biāo)比較(±s) mmol/L

2.3 冠心病組-565C/T基因多態(tài)性各基因型與冠狀動脈病變支數(shù)的關(guān)系 -565C/T基因的雙支病變組、多支病變組各基因型及其等位基因與單支病變組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明-565C/T這兩個基因的TT基因型和T等位基因與冠狀動脈病變范圍有關(guān)，TT基因型和T等位基因增加冠狀動脈病變范圍。詳見表4。

表4 冠心病組-565C/T基因型與冠狀動脈病變支數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.4 冠心病組-565C/T基因多態(tài)性各基因型與冠狀動脈病變程度的關(guān)系 -565C/T B型病變組、C型病變組各基因型及其等位基因與A型病變組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明-565C/T這兩個基因的TT基因型和T等位基因與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)，可以增加冠狀動脈的病變程度。詳見表5。

2.5 -565C/T基因酶切電泳圖(見圖1) TT型等位基因的351bp擴(kuò)增產(chǎn)物有278bp、73bp兩個片段，而CC基因型可被切成148bp、130bp、73bp 3個片段，TC基因可被切成278bp、148bp、130bp、73bp 4個片段。

圖1 -565C/T酶切產(chǎn)物及Marker電泳圖

3 討 論

ABCA1的功能是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇外流到載脂蛋白，并將其包裝成HDL-C，ABCA1是調(diào)節(jié)血漿HDL-C及細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的重要載體，對控制動脈粥樣硬化的形成起著舉足輕重的作用。如果ABCA1基因突變，膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)流出至細(xì)胞外的過程發(fā)生障礙，使膽固醇和磷脂流出減少，進(jìn)而使載脂蛋白A1不能與之有效結(jié)合，很快經(jīng)腎臟清除，由此HDL-C合成障礙，會引起大量膽固醇和膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚而成為泡沫細(xì)胞，繼而浸潤血管壁，促進(jìn)動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。ABCA1基因不同位點(diǎn)的變異與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及血脂密切相關(guān)，有一些變異使HDL-C水平增高[1-2]，具有抗動脈粥樣硬化和減少冠心病危險性的作用[3-6]，如：R219K。有些變異使HDL-C水平下降，如R230C、R1587K、V8251[7]，在啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性增加冠心病的危險性，如：C69T[8-9]。有些變異可能沒有或很少影響到ABCA1的功能，與血漿HDL-C水平變化無明顯相關(guān)性，如-14bp和ZNF位點(diǎn)[10]。

ABCA1基因位于染色體9q31，其啟動子區(qū)的-565C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性 r82422493是胸腺嘧啶取代胞嘧啶。關(guān)于冠心病與-565C/T基因多態(tài)性的相關(guān)研究，國內(nèi)外有不同的研究結(jié)論報道。Babashamsi等[11]報道-565C/T T等位基因增加α低脂蛋白血癥風(fēng)險，并且降低HDL-C，升高TG、IL-6和C反應(yīng)蛋白。Ruiz等[12]報道-565C/T T等位基因增加亞臨床型心血管疾病的危險性，并且與冠狀動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)。Rejeb等[13]的報道與Ruiz等[12]不一致，Rejeb等[13]研究結(jié)果表明突尼斯人-565C/T變異與冠心病無相關(guān)性，說明-565C/T不是冠心病的易感基因，這與本研究結(jié)果基本一致，即ABCA1基因-565C/T等位基因變異在冠心病和對照組之間的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與冠心病的發(fā)病亦無顯著相關(guān)性，但-565C/T TT基因型和T等位基因與冠狀動脈病變支數(shù)和冠狀動脈病變程度相關(guān)，也就是說-565C/T TT基因型和T等位基因雖然不是冠心病的易感基因但增加冠狀動脈病變范圍和加重冠狀動脈病變程度，Qi 等[14]研究表明這種增加冠狀動脈病變嚴(yán)重程度的原因與TT基因型ABCA1的蛋白表達(dá)以及膽固醇外流功能減低有關(guān)，推測TT基因型通過影響ABCA1蛋白表達(dá)進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞膽固醇外流功能，促進(jìn)冠狀動脈病變范圍和嚴(yán)重程度進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展，它是不依賴于影響中間表型如HDL-C、 LDL-C、TG等變化的。

本研究雖然未能發(fā)現(xiàn)-565C/T基因多態(tài)性與冠心病及HDL-C等有關(guān)聯(lián)性，但發(fā)現(xiàn)TT基因型和T等位基因雖然不是冠心病的易感基因但增加冠狀動脈病變范圍和加重冠狀動脈病變程度，這對于將來開發(fā)和尋找有關(guān)ABCA1基因表達(dá)具有特異性調(diào)控作用的藥物奠定了一定的基礎(chǔ)，對預(yù)防和治療高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病等都具有十分重要的意義。由于在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)及防治心血管疾病方面的重要作用，近幾年ABCA1引起了人們的廣泛興趣，其表達(dá)調(diào)控成為研究的熱門領(lǐng)域。隨著對ABCA1基因認(rèn)識的深入，針對ABCA1介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)運(yùn)及基因多態(tài)性的研究將有助于探討人類重大疾病冠心病的發(fā)病機(jī)制以及其與冠狀動脈嚴(yán)重程度的關(guān)系，將為ABCA1的基因診斷及基因治療的開展提供重要的依據(jù)。