兒童產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥性及基因型研究

陳泗虎 李 凱 張勝翔 李昌崇

肺炎克雷伯菌是一種陰性腸桿菌，是引起醫(yī)院感染的重要陰性桿菌，隨著廣譜β-內(nèi)酰胺和其他類型抗菌劑的廣泛使用，多重耐藥的肺炎克雷伯菌日益增多。多重耐藥菌不僅給臨床治療帶來(lái)很大難度，也給抗菌藥物的研制和應(yīng)用帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)[1～3]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的酶，可以水解青霉素，頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺抗生素。因其用底物廣泛而被稱之為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，可通過(guò)質(zhì)粒在不同種類的細(xì)菌之間傳播[4～6]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)種類繁多，目前，產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌在大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)都有報(bào)道。由于使用抗生素的不同，不同國(guó)家或地區(qū)報(bào)道肺炎克雷伯菌感染的流行情況，不同醫(yī)院產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌檢出率也不同[7～9]。本研究分析了從筆者醫(yī)院分離出的110株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐藥性和耐藥基因類型，為院內(nèi)交叉感染的確定及臨床實(shí)踐中抗菌藥物的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步探索產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.菌株的來(lái)源：產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶110株肺炎克雷伯桿菌從筆者醫(yī)院2017年7月～2018年7月住院兒童患者的痰液、尿液、血液等各類標(biāo)本分離得到，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

2.主要儀器及試劑：全自動(dòng)微生物分析儀Walkaway 96SI西門子醫(yī)療系統(tǒng)集團(tuán)；凝膠照相及圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海復(fù)日科技公司；Bio-Rad power/PAC 3000型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；藥敏紙片與M-H瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；PCR反應(yīng)體系、Taq酶、2kb PCR marker 2等購(gòu)自寶生生物工程(大連)有限公司。

3.細(xì)菌的復(fù)蘇及鑒定：將冷凍保存的菌株在室溫下溶解，接種于血液板上，在35℃下培養(yǎng)18～24h，觀察到菌落為較大、凸起、灰白色黏液型的菌落。細(xì)菌經(jīng)革蘭染色顯微鏡鑒定為G-球菌。全自動(dòng)微生物鑒定儀Walkaway 96SI鑒定細(xì)菌。

4.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的確證：根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)1999年推薦的紙片擴(kuò)散法對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表型確證試驗(yàn)進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的確認(rèn)。根據(jù)紙片法的規(guī)定接種菌株于M-H平板上，貼各種抗生素紙片(頭孢噻肟30μg、頭孢噻肟/克拉維酸30μg/10μg、頭孢他啶30μg、頭孢他啶/克拉維酸30μg/10μg)，在35℃培養(yǎng)16～18h, 兩種藥物中任何一種，添加克拉維酸后的抑菌環(huán)直徑均大于無(wú)克拉維酸的抑菌環(huán)直徑，當(dāng)抑菌環(huán)直徑≥5mm時(shí)，可判定超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。

5.藥敏試驗(yàn)：抗菌藥物敏感度試驗(yàn)對(duì)19種抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌的MIC值采用2008年版《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)》所推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定。K-B紙片擴(kuò)散法確定， Whonet 5.4軟件用于分析藥敏資料，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用例(百分比)[n(%)]表示。

6.耐藥基因的檢測(cè)與分型：(1)基因組DNA的提?。簩⑿铚y(cè)細(xì)菌菌株在LB肉湯培養(yǎng)基接種，在37℃下孵化20h，然后取1.5ml在12500r/min離心機(jī)上離心5min，棄上清，加去離子水500μl，95℃加熱10min，12500r/min離心5min，上清液即為模板DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)ESBLs耐藥基因PCR擴(kuò)增與分型:用特異性CTX-M-1、CTX-M-9、CTX-M-2、CTX-M-8、SHV、TEM型等6對(duì)引物對(duì)細(xì)菌進(jìn)行DNA擴(kuò)增。TEM型：引物1:5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′；引物2：5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′。SHV型: 引物1：5′-TCGGCCTTCACTCAAGGAATG-3′；引物2：5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。CTX-M-1組型：引物1：5′-CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG-3′；引物2：5′-GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC-3′。CTX-M-9組型：引物1：5′-GAGAGTGCAACGGATGATGT-3′； 引物2：5′-GATGATTCTCGCCGCTGAAG-3′。CTX-M-2組型：引物1：5′-CTCAGAGTATTCGCCGCTCA-3′； 引物2：5′-CCGCCGCAGCCAGAATATCC-3′。CTX-M-8組型：引物1：5′-ACTTCAGCCACACGGATTCA-3′； 引物2：5′-AAGTGGAGCGACAGAGC-3′。大連寶生物工程有限公司合成6對(duì)引物。PCR 體系含有200μmol/L dNTP,1×PCR緩沖液，10μl質(zhì)粒DNA模板,2U Taq酶。PCR循環(huán)參數(shù): 94℃ 5min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物10μl用1.0%瓊脂糖凝電泳，電泳結(jié)果在紫外光下觀察，使用SYNGENE凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理分析。

結(jié) 果

1.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌對(duì)19種抗生素的耐藥性分析:產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的耐藥率詳見表1。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌表現(xiàn)為多重耐藥性，對(duì)頭孢唑啉、頭孢唑啉、頭孢噻嗪、頭孢噻嗪等頭孢菌素具有較高的耐藥性，耐藥率為77.2%～86.0%。酶抑制復(fù)合制劑的耐藥率為31.8%～80.0%，對(duì)亞胺培南耐藥率為0。

表1 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌的耐藥情況(n=110，%)

2.產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌PCR結(jié)果：用PCR方法檢測(cè)了110株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的肺炎克雷伯桿菌的基因型。分別以CTX-M-1組、CTX-M-2組、CTX-M-8組、CTX-M-9組、TEM型、SHV型等6組引物對(duì)110株菌的耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增呈陽(yáng)性的DNA片斷長(zhǎng)度位置與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生的DNA片段位置一致，均與預(yù)期長(zhǎng)度相符合(圖1～圖4)。在經(jīng)表型確證實(shí)驗(yàn)明確為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶110株陽(yáng)性菌的各耐藥基因引物擴(kuò)增中，引物擴(kuò)增呈陽(yáng)性株菌有88株，其PCR結(jié)果詳見表2。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶110株肺炎克雷伯桿菌的基因型構(gòu)成結(jié)果詳見表3。

圖1 TEM型引物PCR擴(kuò)增結(jié)果M.marker；P.陽(yáng)性模板；N.陰性對(duì)照； 1～5.陽(yáng)性菌株

圖2 CTX-M-9組型引物PCR擴(kuò)增結(jié)果M.marker；P.陽(yáng)性模板；N.陰性對(duì)照；1～5.陽(yáng)性菌株

圖3 CTX-M-1組型引物PCR擴(kuò)增結(jié)果M.marker；P.陽(yáng)性模板；N.陰性對(duì)照；1～6.陽(yáng)性菌株

圖4 SHV型引物PCR擴(kuò)增結(jié)果M.marker；N.陰性對(duì)照；1～5.陽(yáng)性菌株

表2 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌菌株P(guān)CR結(jié)果

表3 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌基因型構(gòu)成

討 論

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的酶，可以水解青霉素、頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺抗生素。因其用底物廣泛而被稱之為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，可通過(guò)質(zhì)粒在不同種類的細(xì)菌之間傳播[4～6]。這些酶屬于Bush-Jacoby-Medeiros最新分類法中的2be群[10]。目前ESBLs大部分由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生，其中主要以肺炎克雷伯桿菌產(chǎn)生為主。

自從1983年德國(guó)首次報(bào)道了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株以來(lái)，在全世界各地都有廣泛報(bào)道產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的流行[11～14]。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化以及接合等形式，細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs能夠轉(zhuǎn)移或者獲得相關(guān)的耐藥基因。通過(guò)質(zhì)粒在相同種屬之間進(jìn)行傳遞，可能造成院內(nèi)感染大規(guī)模發(fā)生，目前產(chǎn)ESBLs菌株感染造成的暴發(fā)性流行報(bào)道有許多[15，16]。

本研究結(jié)果表明,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌對(duì)青霉素類耐藥率，哌拉西林為85.3%，而對(duì)第3代頭孢菌素的耐藥率頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟均為77.2%，均有較高的耐藥性，這與盧彥等[17]報(bào)道基本相符，這說(shuō)明他們是ESBLs適宜的水解底物，提示產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌感染的治療難度很大。對(duì)左氧氟沙星耐藥率為30.0%，環(huán)丙沙星耐藥率為34.5%，低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道[18]?？紤]可能與本研究的菌株來(lái)自于兒童醫(yī)院的患者，而兒童是慎用喹諾酮類抗生素的，導(dǎo)致抗生素的選擇壓力較小而引起耐藥性相對(duì)較低有關(guān)。哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦等酶抑制復(fù)合制劑的耐藥率分別為31.8%、80.0%。相對(duì)于其他地區(qū)本結(jié)果中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類抗生素有較高的耐藥率，原因可能與兒童感染患者廣泛應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類抗生素有關(guān)。對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類耐藥率為0，保持高度敏感度。關(guān)于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌感染患兒的治療，病情輕者根據(jù)藥敏結(jié)果可酌情應(yīng)用酶抑制復(fù)合制劑類抗生素，對(duì)于重癥感染的治療應(yīng)以碳青霉烯類抗生素作為首選，同時(shí)需結(jié)合患者的具體情況開展個(gè)體化治療。

目前，已發(fā)現(xiàn)接近700種質(zhì)粒介導(dǎo)ESBLs的基因型，其中以TEM、 SHV、OXA、 CTX-M等基因型居多[19]。Castanheira等[20]報(bào)道，美國(guó)感染ESBLs細(xì)菌的基因型以SHV-12和TEM-1型為主。林海波等[21]報(bào)道的中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)以CTX-M-3型和SHV-12型為主。高偉等報(bào)道安徽地區(qū)ESBLs細(xì)菌的基因型以CTX-M-22型、CTX-M-14型為主。本研究結(jié)果中，在經(jīng)表型確證實(shí)驗(yàn)明確為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶110株陽(yáng)性菌的各耐藥基因引物擴(kuò)增中，引物擴(kuò)增呈陽(yáng)性株菌有88株。TEM型占41.8%，SHV型占4.5%，CTX-M-1型占42.7%，CTX-M-9型占32.7%。不同國(guó)家及國(guó)內(nèi)不同地區(qū)流行的ESBLs病原菌基因型存在差異，考慮主要與各地區(qū)患兒所使用的抗菌藥物的種類、劑量等不同有關(guān)。另外本研究結(jié)果中檢出兩種或兩種以上的耐藥基因型共同存在的菌株有41株(37.3%),主要為CTX-M-1型與CTX-M-9型或TEM型共同存在，這一現(xiàn)象說(shuō)明產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌可同時(shí)攜帶兩種或兩種以上廣譜酶。另外有22株6對(duì)引物擴(kuò)增均為陰性，但其耐藥表型為超廣譜β內(nèi)酰胺酶，故其耐藥基因型有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯桿菌感染已成為兒童臨床感染性疾病治療的難題。兒科醫(yī)生在臨床工作中，要結(jié)合藥敏結(jié)果，合理應(yīng)用抗生素，特別是第3代頭孢菌素，延緩耐藥菌株的產(chǎn)生，要輪換使用抗生素等，對(duì)控制產(chǎn)ESBLs菌株醫(yī)院感染將起到十分重要的作用。