大腸桿菌持留菌株與抗藥菌株生長優(yōu)勢的比較

胡明 付曉杰 張慶 齊靜 駱延波 李璐璐 劉玉慶

摘要：以64倍最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氨芐西林、環(huán)丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物分別處理大腸桿菌ATCC 25922，去除藥物后，保持原始菌株藥物敏感性的存活菌株為持留菌株;另用濃度遞增的亞致死量的三種抗菌藥物培養(yǎng)基連續(xù)對大腸桿菌ATCC 25922進行分批培養(yǎng)，獲得能夠耐受一定藥物濃度的抗藥性增強的菌株，去除藥物后，菌株穩(wěn)定的MIC值仍顯著高于原始菌株，為抗藥菌株。以穩(wěn)定的MIC范圍為檢測指標，比較原始菌株的持留菌株和抗藥菌株后續(xù)的生長優(yōu)勢。結(jié)果表明：經(jīng)過一段時間的混合培養(yǎng)，持留菌株在95%以上，數(shù)量上占絕對優(yōu)勢，說明持留菌株比抗藥菌株具有更強的生長優(yōu)勢，由此引發(fā)對抗藥性回復(fù)的重新思考，自然界中持留菌株的特性、形成及存在可能為抗藥性的逆轉(zhuǎn)預(yù)留了一條途徑。

關(guān)鍵詞：抗藥性;持留性;抗藥菌株;持留菌株;最小抑菌濃度（MIC）;生長優(yōu)勢

中圖分類號：S852.61文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）07-0108-05

抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)和使用大大降低了細菌感染性疾病導(dǎo)致的死亡率，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，人類和動物病原菌的抗藥性問題凸顯并引起全球高度關(guān)注[1]。抗菌藥物使用之初就有相關(guān)抗藥性的報道，至今有關(guān)細菌抗藥性的起源、發(fā)展和傳播已有了相當(dāng)?shù)姆e累。研究表明細菌抗藥性可以通過多種機制產(chǎn)生，如編碼靶蛋白的基因突變、藥物滲透降低、細菌外排泵的外排功能激活、靶蛋白旁路、非酶的靶位保護、酶靶位修飾等，細菌通過整合各種可能的機制形成抗藥性表型，并且可遺傳的抗藥性能夠通過可移動遺傳因子進行水平轉(zhuǎn)移[2]，尤其在抗菌藥物選擇壓力下，越來越多的“超級細菌”逐漸產(chǎn)生，對人類健康造成巨大威脅[3]。

細菌的持留性（persistance）不同于抗藥性，表型上，持留菌雖然也能夠耐過遠高于MIC的藥物濃度得以存活，卻保留了原始菌株的藥物敏感特性。早在1944年，Bigger發(fā)現(xiàn)青霉素并不能完全殺死金黃色葡萄球菌，其中極小一部分可以存活，認為其表現(xiàn)為休眠狀態(tài)、非可遺傳表型[4]?？咕幬锟梢詺⑺来蟛糠旨毦?，但總有一小部分不能被抗菌藥物殺滅，當(dāng)這些存活的亞群在同樣的抗菌藥物條件下生長，會重復(fù)這種異質(zhì)特性，這種現(xiàn)象叫做細菌持留性，存活的細菌叫做持留菌[5]。持留菌的形成機制尚不明確，目前已有的研究包括持留性相關(guān)基因如hipA[6]、毒素/抗毒素（TA）系統(tǒng)[7]和外排泵系統(tǒng)[8]等，與細菌抗藥性一樣，持留性也是多因素共同參與形成的。

持留菌和抗藥菌的本質(zhì)和形成機制不同，但共存于抗菌藥物壓力下的細菌群體中。在對持留菌的研究中，普遍認為持留菌在抗藥性中起到了至關(guān)重要的“幫兇”作用，研究思路多為阻斷持留菌的形成和阻止進入休眠狀態(tài)[6-8]。而本文思路是從生態(tài)角度審視抗菌藥物使用過程中，休眠的持留菌在抗藥性回復(fù)中可能的作用及當(dāng)去除藥物后二者在菌群后續(xù)繁殖中各自發(fā)揮怎樣的作用。在體外條件下采用氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素三種不同類型的常用抗菌藥物，以不同方式對原始菌株進行處理，獲得原始菌株的持留菌株和抗藥菌株，比較其藥敏特性和相同生態(tài)環(huán)境中的生長優(yōu)勢，并探討持留菌存在的意義及其在抗藥性回復(fù)中潛在的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

試劑與藥品：氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素，購自中國藥品生物制品檢定所，分析純;MH液體培養(yǎng)基（MHB）、MH固體培養(yǎng)基（MHA），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MIC測定 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建立的標準藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法[9]，測定原始菌株、持留菌及抗藥菌株對氨芐西林、環(huán)丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.2.2 高藥物濃度下獲得持留菌株 用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌ATCC 25922 MIC后，在96孔板上，將氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的藥物濃度分別設(shè)置為各種藥物MIC的64倍（氨芐西林256μg/mL，環(huán)丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL），按照藥敏試驗方法的接種量接入穩(wěn)定期大腸桿菌ATCC 25922，每種藥做18個重復(fù)孔，37℃靜置培養(yǎng)。分別于6 d內(nèi)每天取3個重復(fù)樣，將每孔液體共200μL全部取出，10 000 r/min 離心5 min，用200μL生理鹽水洗滌2次，加50μL生理鹽水重懸后涂布MHA平板，培養(yǎng)24 ～?48 h，計算菌落數(shù)，測定MIC。

1.2.3 在遞增的亞致死量藥物濃度下分批傳代獲得抗藥菌株 取大腸桿菌ATCC 25922接種于裝有50 mL MHB的三角瓶中（接種量為1%，V/V），氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的終濃度分別為各自的1/2 MIC，12 h后轉(zhuǎn)接到下一個三角瓶中（藥物濃度不變），培養(yǎng)12 h后再轉(zhuǎn)接到藥物濃度倍增的三角瓶中;藥物濃度由1/2 MIC連續(xù)倍比遞增至64倍MIC，每一濃度傳代2次，第二次培養(yǎng)細菌生長后劃線于含相同濃度藥物的MHA平板，過夜培養(yǎng)，挑取生長良好的單菌落并測定MIC。然后將其在無藥MHB中連續(xù)傳代直至MIC穩(wěn)定，獲得一系列MIC穩(wěn)定的抗藥性增強的菌株。

1.2.4 持留菌株與抗藥菌株的生長曲線測定 將獲得的原始菌的持留菌株和抗藥菌株在島津2500 UV-VIS光譜儀中37℃培養(yǎng)900 min，每15 min在線連續(xù)測量OD600，比較不同菌株的生長曲線是否存在差異。

1.2.5 持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍 分別選取氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素三種藥物原始菌的持留菌株和抗藥菌株，挑取單菌落分別接種于等體積的MHB中，以同樣的條件振蕩培養(yǎng)16 ～?18 h，各取菌液1 mL稀釋至適當(dāng)濃度，涂布于MHA平板獲得單菌落，各取100個單菌落進行MIC測定[9]，統(tǒng)計不同菌株各自的MIC分布范圍。

1.2.6 持留菌株和抗藥菌株生長優(yōu)勢的比較 根據(jù)1.2.5中測定的MIC頻率分布結(jié)果，選取各自MIC范圍沒有交叉的持留菌株和抗藥菌株，等比例接種培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，以各自MIC為檢測指標統(tǒng)計二者組成比例的變化。具體方法：挑取氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株的單菌落，分別接種于MHB中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用MHB稀釋，于紫外-可見光分析儀（GE Ultrospec 3100 pro）檢測OD600，調(diào)節(jié)至0.08 ～?0.10范圍內(nèi)，盡量調(diào)整稀釋倍數(shù)使其最終達到相同的OD600值，確保小數(shù)點后兩位相同。以此濃度各取500μL，同時接種于含有100 mL MHB的三角瓶中，等比例接種后混合振蕩培養(yǎng)，每天取1 mL轉(zhuǎn)接入新的100 mL MHB中，連續(xù)轉(zhuǎn)移傳代7 d甚至更長時間。每次培養(yǎng)后取混合菌液稀釋至合適濃度，涂布獲得單菌落100株，測定其MIC。以1.2.5中測定的MIC頻率分布為指標，統(tǒng)計菌液中持留菌株和抗藥菌株來源的大腸桿菌的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 高藥物濃度下獲得持留菌株

在高藥物濃度的培養(yǎng)條件（氨芐西林256μg/mL，環(huán)丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL）下，持續(xù)作用6 d，依然能夠檢測到存活的細菌。按照接種量104 cfu/mL數(shù)量級計算，存活率在0.1%左右（表1）。此試驗結(jié)果表明，即使在有限的空間內(nèi)，只要初始接種量達到一定數(shù)量，高于致死濃度的抗菌藥物并不能完全殺死細菌，總會有一小部分細菌存活下來。

在藥物氨芐西林濃度為256μg/mL條件下，先后共收集存活的細菌134株，測定其MIC，90%以上的菌株與原始菌株持平，少數(shù)略高于原始菌株一個或兩個梯度，均遠遠低于其生存環(huán)境的藥物濃度。環(huán)丙沙星和多粘菌素作用下的群體也存在同樣的現(xiàn)象（數(shù)據(jù)略）。這些在高濃度藥物作用下存活的細菌，其MIC卻保持不變，為持留菌。致死量的抗菌藥物不能將其殺滅，說明持留菌通過某種機制耐過了高濃度的藥物，并且保持了原有的藥物敏感特性。隨機選取其中一株氨芐西林的持留菌，在氨芐西林濃度為256μg/mL的環(huán)境中得以存活，測定其分裂繁殖的后代實際MIC為4μg/mL，經(jīng)傳代后MIC保持不變，命名為菌株P(guān)-A，是原始菌株持留菌株繁殖后代的純培養(yǎng)。

用同樣的方法獲得環(huán)丙沙星和多粘菌素作用下的持留菌株，分別耐過的藥物濃度為1μg/mL和32μg/mL，保持原始菌株的MIC分別為0.0156μg/mL和0.5μg/mL不變。

2.2 在遞增的亞致死量藥物濃度下傳代獲得抗藥菌株

在藥物選擇壓力不斷提高的試驗條件下獲得一系列抗藥性增強的菌株，能夠在相應(yīng)藥物濃度下繼續(xù)生長繁殖。這些菌株的MIC值遠遠高于原始菌株MIC。由于存在多種形成機制，在藥物去除后有些抗藥機制關(guān)閉，而有些抗藥機制是穩(wěn)定的，因此，在無藥培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，抗藥菌株的MIC值有不同程度的回落，但都難以回復(fù)到原始菌株的敏感性。

經(jīng)遞增的亞致死量氨芐西林連續(xù)培養(yǎng)后，選取一株MIC穩(wěn)定的耐過氨芐西林256μg/mL的抗藥菌株，傳代后MIC穩(wěn)定在128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍，命名為R-A。

用同樣的方法獲得環(huán)丙沙星和多粘菌素的抗藥菌株，選取耐過1μg/mL環(huán)丙沙星和32μg/mL多粘菌素的抗藥菌株，穩(wěn)定的MIC分別為0.5μg/mL和8μg/mL。

2.3 持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍

MIC值表示菌株對藥物的敏感程度，是一個群體概念。由于細菌群體具有異質(zhì)性，純培養(yǎng)的細菌群體中小亞群的MIC也可能有所差異。因此，MIC并非一個準確的數(shù)值，而是一個范圍。為了后續(xù)比較生長優(yōu)勢，先檢測各類菌株的MIC范圍，分別取100個單菌落測定MIC分布情況。氨芐西林藥物處理的菌株MIC統(tǒng)計結(jié)果如表2，P-A的MIC分布峰值為4μg/mL，MIC與原始菌株持平;R-A的MIC分布峰值為128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍。經(jīng)過傳代培養(yǎng)證明，兩個菌株的MIC范圍是穩(wěn)定的表型指標，可以作為判定菌株性質(zhì)的指標。對環(huán)丙沙星和多粘菌素處理菌株的穩(wěn)定MIC范圍也按同樣的方法進行統(tǒng)計（數(shù)據(jù)略）。

2.4 持留菌株和抗藥菌株生長優(yōu)勢的比較

經(jīng)檢測，不同藥物作用下篩選的兩類菌株的生長曲線并無明顯差異（生長曲線圖略），因此可采取混合培養(yǎng)的方式，以各自MIC為衡量指標比較其生長優(yōu)勢。

氨芐西林處理的P-A和R-A菌株MIC范圍無相互交叉，將二者等比例混合接種培養(yǎng)，根據(jù)穩(wěn)定的MIC范圍統(tǒng)計其比例變化。如圖1所示，混合培養(yǎng)后，持留菌株P(guān)-A所占比例逐漸升高，到第4 d增至70%以上，至第7 d抗藥菌株R-A比例低于5%，菌株P(guān)-A數(shù)量占絕對優(yōu)勢。此結(jié)果表明，在沒有藥物的培養(yǎng)條件下，P-A具有更強的生長優(yōu)勢。隨機挑選氨芐西林作用下存活的其它持留菌株和抗藥菌株，用同樣的方法對比其生長優(yōu)勢，也有類似的結(jié)果（數(shù)據(jù)略）。另外兩種藥物環(huán)丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株，生長優(yōu)勢的比較也存在類似結(jié)果（數(shù)據(jù)略），最終都能體現(xiàn)出持留菌株具有更強的生長優(yōu)勢。本研究中共檢測8組菌株的對比，未檢測到例外情況。

3 討論與結(jié)論

3.1 細菌抗藥性的意義

抗菌藥物的廣泛應(yīng)用是篩選與富集抗藥菌株的主要推動力，卻并非抗藥性產(chǎn)生的根源[10]?？顾幓驈V泛而普遍地存在于環(huán)境中—病原菌、共生菌及多種環(huán)境微生物[11]。越來越多的研究表明，抗藥性是細菌的一個自然屬性[12]，徹底消除抗藥性是不可能的。由于細菌遺傳物質(zhì)的自發(fā)突變、藥物壓力的篩選和誘導(dǎo)、復(fù)雜多樣的抗藥性機制、不可避免地與周圍環(huán)境微生物接觸等眾多因素，即使在有限的空間內(nèi)和特定條件下也難以完全消除細菌抗藥性。從另一個方面看，抗藥性對于細菌本身而言則意味著物種能夠克服環(huán)境抗菌藥物壓力得以延續(xù)和存活，對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性起到了重要作用，對動物（包括人）免疫系統(tǒng)的形成、健康乃至整個生態(tài)環(huán)境都具有重大影響[13，14]。

細菌的抗藥性為菌株提供了額外的生物學(xué)特性，幫助提高微生物對特定環(huán)境的適應(yīng)性，同時多數(shù)情況下會付出一定的抗性代償，包括生長繁殖能力降低。因此，理論上原始菌株比抗藥菌株具有更強的生長優(yōu)勢，但在抗菌藥物壓力下具有更強生長優(yōu)勢的原始敏感菌被殺死，而抗藥菌株的敏感性回復(fù)則是復(fù)雜漫長的過程[15]。

3.2 持留菌的存在及在抗藥性回復(fù)中的潛力

在林林總總的抗藥表型和抗藥機制中，持留菌以其獨特的機制引起人們的注意。持留菌通過“休眠-恢復(fù)生長-增殖”的方式維持自身的生存和菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，巧妙躲過外界惡劣環(huán)境的影響而存留下來，但依然保持著原始菌株的特性。比較持留菌株與抗藥菌株的生長優(yōu)勢，可引發(fā)對抗藥性回復(fù)問題的重新思考。本文研究結(jié)果表明當(dāng)去除抗菌藥物壓力后，抗菌藥物壓力下存活的持留菌株比抗藥菌株具有更強的生長優(yōu)勢，這一結(jié)論尚未見其它類似文獻。雖然持留菌的作用尚未經(jīng)過全面驗證，但面對生態(tài)中嚴峻的抗藥性問題，持留菌的存在和特性還是提供了一線希望。在環(huán)境中抗菌藥物壓力不斷增大的過程中，存留了一批批“沉睡”的“種子”——持留菌。當(dāng)藥物壓力逐漸降低，人們對于抗藥性水平降低的期待不僅停留在抗藥菌株的敏感性恢復(fù)[10]，也在于預(yù)留的持留菌“蘇醒”并恢復(fù)活力，以更為原始的菌株特性與現(xiàn)存的抗藥性細菌共同競爭，而多數(shù)抗藥性細菌可能由于其抗性代償而處于劣勢。只有環(huán)境中菌群的抗藥性水平整體回落才能根本解決抗藥性問題，并非對抗藥菌斬盡殺絕，也非阻斷所有抗藥性機制。本研究結(jié)論表明，持留菌的存在和形成機制保留了原始菌株的生長優(yōu)勢，隨著抗菌藥物使用水平的降低，可能在抗藥性的逆轉(zhuǎn)中起到一定作用。

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