維格列汀對大鼠非酒精性脂肪肝的影響

廖慶輝，郭中秋，賴康保，譚婭琴，陳玉華

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東 深圳 518000)

隨著生活方式轉(zhuǎn)變，非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率明顯升高，導(dǎo)致脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌發(fā)病率升高，嚴(yán)重影響患者健康，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。核因子κB(NF-κB)是炎癥的中心環(huán)節(jié)，也是癌變過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)是NF-κB信號通路下游的致炎因子，二者表達(dá)增加可促進肝臟炎性損傷，是導(dǎo)致脂肪性肝炎、肝硬化的重要機制之一。解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)基因是與肥胖相關(guān)的易感基因，與胰島素抵抗、脂代謝紊亂、能量代謝及氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而這些因素均不同程度地參與了脂肪肝的形成[1-2]。維格列汀作為新型抗高血糖藥物，具有改善肝內(nèi)脂肪沉積的作用。本研究構(gòu)建NAFLD模型大鼠，探討維格列汀對NAFLD大鼠血清炎性因子、肝功能及肝組織UCP2表達(dá)的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

TRIzol(美國Gibio)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒(大連TaKaRa)，IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(武漢華美)，DAB顯色試劑盒(福建邁新)，UCP2抗體(美國Abcam)。動物IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)(蘇杭儀器)，病理切片機(德國Leica)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)，微量核酸儀(北京奧凱)，7500型實時PCR儀(美國ABI)。SD大鼠24只，體質(zhì)量(158.3±9.3)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)，實驗動物許可證號：SCXK(粵)2016-0041。

1.2 實驗分組及處理

SD大鼠24只，按隨機數(shù)字表分成正常組、模型組和干預(yù)組，每組8只。模型組大鼠正常飲食，使用5% CCl4花生油溶液(0.3 mL/10 g)多點皮下注射，1次/5天，建立NAFLD大鼠模型。正常組大鼠正常飲食，皮下注射等量生理鹽水，1次/5天。干預(yù)組大鼠正常飲食，在造模處理的同時，給予維格列汀50 mg(kg·d)灌胃。第8周斷頭處死各組大鼠，進行各項指標(biāo)檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1炎性因子檢測 各組大鼠第8周斷頭取血分離血清，采用ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平。

1.3.2肝功能檢測 斷頭取血分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。

1.3.3病理學(xué)檢查 第8周斷頭處死各組大鼠，逐層剪開大鼠腹腔皮膚黏膜，打開腹腔后迅速摘除肝左葉，4%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠肝組織病理變化。1.3.4UCP2 mRNA表達(dá)檢測采用實時PCR檢測各組大鼠肝組織UCP2 mRNA的表達(dá)。用TRIzol法常規(guī)提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，熒光定量實時PCR檢測UCP2 mRNA表達(dá)。引物序列：UCP2上游引物5′-CTCCCAATGTTGCCCGAAAT-3′，下游引物5′-GAGGTCGTCTGTCATGAGGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GATGCTGGTGCTGAGTATG CCG-3′，下游引物5′-GTGGTGCAGGATGCATTG CTCTGA-3′。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，10 mol/L上下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至總體積20 μL。將PCR管置于PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。由熔解曲線來判斷引物特異性，若同一對引物的所有樣品的熔解曲線均是單一峰且峰值一致則表示該引物特異性良好。繪制熔解曲線和擴增曲線，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.5UCP2蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化試劑盒檢測各組大鼠肝組織UCP2蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 炎性因子及肝功能檢測

干預(yù)組大鼠血清IL-6、TNF-α水平較模型組均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。肝功能指標(biāo)檢測顯示，干預(yù)組大鼠血清ALT、AST較模型組均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清炎性因子、肝功能指標(biāo)檢測

注：與模型組比較，*P<0.05

2.2 肝組織病理改變

HE染色觀察各組大鼠肝組織病理改變，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞未見明顯脂肪變性，細(xì)胞核清晰可見；模型組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏散，含脂肪粒，肝細(xì)胞核固縮；干預(yù)組肝細(xì)胞趨于正常，脂肪粒變小。見圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：干預(yù)組

圖1 第8周3組大鼠肝組織病理改變(HE染色 ×400)

2.3 UCP2 mRNA表達(dá)檢測

實時PCR檢測大鼠肝組織UCP2 mRNA表達(dá)顯示，模型組UCP2 mRNA表達(dá)明顯高于正常組和干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

2.4 UCP2蛋白表達(dá)檢測

免疫組化顯示，模型組肝組織UCP2蛋白表達(dá)明顯高于正常組和干預(yù)組。見圖3。

圖2 3組大鼠肝組織UCP2 mRNA表達(dá)檢測(熒光定量PCR)

注：A：正常組；B：模型組；C：干預(yù)組

圖3 3組大鼠肝組織UCP2蛋白表達(dá)(免疫組化×400)

3 討 論

UCP2是位于線粒體內(nèi)膜上的一類載體蛋白，對機體能量平衡涉及的體質(zhì)量、肥胖等具有明顯影響，在調(diào)節(jié)能量代謝和線粒體功能方面發(fā)揮重要的作用[3-4]。Beck等[5]研究發(fā)現(xiàn)脂肪變的肝臟中UCP2表達(dá)量增加。肝內(nèi)UCP2對肝臟的能量代謝極為重要，NAFLD肝臟組織UCP2表達(dá)增加，通過其質(zhì)子漏作用，一方面減少ATP合成，增加肝細(xì)胞對損傷因子的靈敏度，使肝細(xì)胞更容易受到打擊；另一方面可減少活性氧的生成，對肝臟起保護作用。

維格列汀是一種具有選擇性、競爭性的可逆二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑。葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)和胰高血糖素樣多肽1(GLP-1)是維持體內(nèi)葡萄糖濃度的重要激素，都具有腸促胰島素作用。2型糖尿病患者GIP的促胰島素分泌作用受損，僅有GLP-1能發(fā)揮促胰島激素分泌作用，它通過作用于胰島β細(xì)胞膜上的受體，促進胰島素分泌；GLP-1還可抑制胰高血糖素的分泌以及抑制胃排空從而增加飽足感，抑制食欲。通過與DPP-4結(jié)合形成DPP-4復(fù)合物可抑制該酶的活性，在提高

GLP-1濃度、促使胰島β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的同時，降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖。維格列汀除了有降糖作用外，還能夠降低NAFLD肝細(xì)胞UCP2的表達(dá)，降低血清IL-6、TNF-α等炎性因子水平，改善肝功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織UCP2表達(dá)較干預(yù)組明顯升高，與上述研究結(jié)果一致，也證實了UCP2在肝臟能量代謝中起重要作用。

綜上述，維格列汀可抑制NAFLD大鼠肝組織UCP2的表達(dá)，降低血清IL-6、TNF-α炎性因子水平，促進肝功能恢復(fù)，為NAFLD的防治提供了新的依據(jù)。