外源褪黑素對NaCl脅迫下扁穗雀麥種子萌發(fā)及幼苗的影響

熊艷麗，熊 毅，趙文達，楊曉鵬，雷 雄，余青青，馬 嘯，張新全

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都 611130）

土壤鹽堿化是農(nóng)業(yè)發(fā)展所面臨的主要危機之一[1]。鹽脅迫下植物細胞內線粒體和葉綠體通過電子傳遞產(chǎn)生過量活性氧，導致OH-、H2O2等自由基的大量積累，引起細胞膜的脂質過氧化、蛋白質變性、色素分解和碳水化合物氧化，從而對植物生長發(fā)育造成不利影響[2]。植物雖能通過防御系統(tǒng)清除活性氧，但在鹽脅迫等逆境條件下植物的防御系統(tǒng)和活性氧水平失衡，從而引起氧化脅迫[3]。扁穗雀麥(Bromus catharticus)為禾本科(Poaceae)、雀麥屬(Bromus)一年生或越年生草本植物，它產(chǎn)量穩(wěn)定、適口性好、綠期長，能有效解決南方冬春牧草供應不足的問題，在煙草輪作、果草間作、糧草輪作上有良好的應用前景[4]。扁穗雀麥主要被引種栽培于我國華東、江蘇等地，但其能否在含鹽量較高的地方種植還不得而知。因此，通過技術措施提高扁穗雀麥的抗鹽性有利于其在鹽堿地分布地區(qū)的推廣利用。

為了提高牧草產(chǎn)量、維持農(nóng)業(yè)發(fā)展的可持續(xù)性，許多植物生長調節(jié)物質已經(jīng)被用于提高植物的耐鹽性，如甜菜堿、水楊酸(salicylic acid, SA)、維生素C等。在過去30年里，科學家證明了褪黑素對于動物具有調節(jié)基因表達、影響抗氧化酶活性、調控抗氧化酶mRNA水平、抗氧化以及調節(jié)晝夜節(jié)律的作用[5]。近年來在植物中也發(fā)現(xiàn)了褪黑素的存在，并證明其對植物抵御高溫[6]、重金屬[7]和低溫[8]脅迫發(fā)揮著重要作用。不僅如此，褪黑素(melatonin, MT)還具有促進種子萌發(fā)[9]、提高保護酶活性[10]與增強清除活性氧能力[11]的功能。這證明了外源MT的施加對緩解植物鹽脅迫的可行性。然而迄今為止，MT對鹽脅迫下扁穗雀麥種子萌發(fā)及其抗氧化系統(tǒng)的影響尚未見報道。因此，本研究以扁穗雀麥為研究材料，探究外源MT對鹽脅迫下扁穗雀麥種子萌發(fā)及其幼苗的形態(tài)和生理指標的影響，旨為MT應用于植物抗逆和鹽脅迫下扁穗雀麥的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

扁穗雀麥品種‘川西'(四川省2017年審定品種)，由四川農(nóng)業(yè)大學牧草課題組提供，2016年收種于四川雅安并保存于-20 ℃冰箱，發(fā)芽率約為95%。種子在試驗前用2%的NaClO消毒30 min，沖洗干凈后用蒸餾水浸種24 h。褪黑素產(chǎn)于上海廣瑞生物有限公司，純度為分析純。

1.2 適用NaCl濃度的篩選和MT濃度的選擇

設置0.2%、0.4%、0.6%、0.8%共4個不同的NaCl濃度，每個處理4個重復，每個重復50粒種子，選擇使發(fā)芽勢降低為對照60%時的NaCl處理濃度作為正式試驗的最佳脅迫濃度，因為發(fā)芽勢太高難以體現(xiàn)MT的作用，而太低則會導致后續(xù)指標測定困難。同時參照我國土壤鹽漬化等級標準(土壤溶液含鹽量 ＞ 0.37%為強鹽漬土)，最終將正式試驗脅迫鹽濃度設置為0.4%。MT處理濃度分別為50、100、300、500 和 1 000 μmol·L-1。

1.3 植物材料培養(yǎng)與處理

消毒浸種后，選取飽滿均一的扁穗雀麥種子，放于10 cm × 10 cm的方形培養(yǎng)皿中，內鋪兩層無菌濾紙。每處理重復4次，每重復50粒種子。每個培養(yǎng)皿加入約5 mL處理液，放于日溫25 ℃ (16 h)、夜溫15 ℃ (8 h)的培養(yǎng)箱中，每2 d更換濾紙，蓋上培養(yǎng)皿塑料蓋并用保鮮膜封住來盡量降低因水分蒸發(fā)而引起的干旱。CK1：于蒸餾水中萌發(fā)。CK2：于0.4% NaCl溶液中萌發(fā)。MT處理：于50、100、300、500、1 000 μmol·L-1溶液中萌發(fā)，分別用MT50、MT100、MT300、MT500和MT1000表示。CK2+ MT：于CK2和MT的混合溶液中萌發(fā)，即CK2+ 50、100、300、500和 1 000 μmol·L-1的混合溶液，分別用 NaCl+MT50、NaCl+MT100、NaCl+MT300、NaCl+MT500、NaCl+MT1000表示?；旌先芤号渲疲涸?00 mL蒸餾水中加入4 g NaCl，再加入不同質量的MT定容至1 000 mL。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 萌發(fā)指標測定

培養(yǎng)期間每天定時測定種子發(fā)芽率，以胚根露出2 mm作為萌發(fā)狀態(tài)，在發(fā)芽高峰期(第5天)統(tǒng)計發(fā)芽勢，發(fā)芽率不再變化后統(tǒng)計發(fā)芽率(第10天)，并測定扁穗雀麥的苗鮮重、根鮮重(苗鮮重、根鮮重記錄為10株幼苗的總重)、苗高、根長(苗高、根長記錄為10株幼苗的平均值)。發(fā)芽率發(fā)芽勢按如下公式計算：發(fā)芽勢 = 5 d內種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù) × 100%，發(fā)芽率 = 10 d內種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù) × 100%。

1.4.2 生理指標測定

剪取萌發(fā)10 d的幼苗，用液氮快速冷凍后放于-80 ℃冰箱超低溫保存。參照《植物生理學實驗教程》[12]測定游離脯氨酸(Pro)含量，采用硫代巴比妥酸法[13]測定過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，采用考馬斯亮藍法[14]測定可溶性蛋白含量，采用愈創(chuàng)木酚法[15]測定過氧化物酶(POD)活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS statistics 19.0進行數(shù)據(jù)匯總與數(shù)據(jù)分析，Excel 2003進行圖表繪制。對不同處理的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan新復極差法進行多重比較(P ＜ 0.05)。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準差表示。為篩選出施用效果最好的外源MT濃度，對扁穗雀麥所有處理的形態(tài)指標和生理指標進行隸屬函數(shù)綜合評價，計算公式為[16]：正向隸屬函數(shù)值 = (X - Xmin) / (Xmax- Xmin)，負向隸屬函數(shù)值 = 1 - (X - Xmin) / (Xmax- Xmin)，式中，X為某一指標測定值，Xmax和Xmin表示此指標的最大值與最小值。本研究中MDA含量為負向指標，其余指標為正向指標。

2 結果與分析

2.1 適用NaCl濃度的篩選

采用蒸餾水(CK1)處理的扁穗雀麥種子發(fā)芽勢(第5天)為66% (圖1)，隨著NaCl濃度的升高，種子的發(fā)芽勢逐漸降低。處理濃度為0.4%時發(fā)芽勢降低至44%，為CK1的60%左右，因此選用0.4%的NaCl作為正式試驗的脅迫濃度。

2.2 MT對鹽脅迫下扁穗雀麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

CK2處理下種子發(fā)芽率為76%，較CK1處理時(93%)顯著降低 (圖 2A)。無 NaCl脅迫下，100～500 μmol·L-1MT 處理的發(fā)芽率與 CK1處理差異不顯著 (P ＞ 0.05)，1 000 μmol·L-1MT 處理的發(fā)芽率顯著降低至80% (P ＜ 0.05)。NaCl脅迫下，隨著MT濃度升高種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但均顯著高于 CK2(P ＜ 0.05)，100 μmol·L-1MT 時發(fā)芽率最高(93%)。

圖 1 NaCl處理對扁穗雀麥種子發(fā)芽勢的影響Figure 1 Effects on germination energy of rescuegrass seeds under NaCl stress不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P ＜ 0.05)。圖2、3、4同。Different letters indicate significant differences between different treatments at the 0.05 level； similarly for Figure 2, 3, and 4.

CK2處理下種子發(fā)芽勢為42.5%，較CK1處理(66%)顯著降低 (P ＜ 0.05) (圖 2B)。無 NaCl脅迫下，50～500 μmol·L-1MT 處理的發(fā)芽勢較 CK1有所提高，其中500 μmol·L-1MT處理時發(fā)芽勢提高幅度最大，發(fā)芽勢達 73.5%；1 000 μmol·L-1MT 時發(fā)芽勢反而下降至50.5%，表明高濃度MT會抑制扁穗雀麥種子的萌發(fā)。NaCl脅迫下，相對于CK2處理，添加MT處理的發(fā)芽勢呈先上升后下降的趨勢，其中300 μmol·L-1MT處理時發(fā)芽勢最高，為71.5%。

2.3 MT處理對鹽脅迫下扁穗雀麥形態(tài)指標的影響

2.3.1 MT對扁穗雀麥根長、根鮮重、苗高和苗鮮重的影響

CK2處理下，根長與根鮮重較CK1處理時顯著降低(P ＜ 0.05)(表1)。無NaCl脅迫下，與CK1相比，MT處理的根長、根鮮重隨MT濃度增加呈先上升后下降的趨勢，100 μmol·L-1MT處理時根長和根鮮重達到最大值，分別為9.41 cm和0.078 g。NaCl脅迫下，添加不同濃度MT處理的根長與根鮮重隨MT濃度增加較CK2也呈先上升后下降的趨勢，且根長、根鮮重分別在MT濃度為50、100 μmol·L-1時達到最大值。

圖 2 外源MT處理對NaCl脅迫下扁穗雀麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響Figure 2 Effects of exogenous melatonin on germination rate and germination energy of rescuegrass seeds under NaCl stress不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05）。CK1：蒸餾水；CK2：0.4% NaCl溶液；MT50：50 μmol·L-1 褪黑素；MT100：100 μmol·L-1褪黑素；MT300：300 μmol·L-1 褪黑素；MT500：500 μmol·L-1 褪黑素；MT1000：1 000 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT50：0.4% NaCl+50 μmol·L-1褪黑素；NaCl+MT100：0.4% NaCl+100 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT300：0.4% NaCl+300 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT500：0.4% NaCl+500 μmol·L-1褪黑素；NaCl+MT1000:：0.4% NaCl+1 000 μmol·L-1褪黑素。表 1、2，圖 3、4 同。Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments at the 0.05 levels. CK1: H2O； CK2: 0.4% NaCl； MT50: 50 μmol·L-1；MT100: 100 μmol·L-1melatonin； MT300: 300 μmol·L-1 melatonin； MT500: 500 μmol·L-1 melatonin； MT1000: 1 000 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT50: 0.4%NaCl+50 μmol·L-1melatonin； NaCl+MT100: 0.4% NaCl+100 μmol·L-1melatonin； NaCl+MT300：0.4% NaCl+300 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT500: 0.4%NaCl+500 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT1000: 0.4% NaCl+1 000 μmol·L-1 melatonin； similarly for Table 1 and Table 2, Figure 3 and Figure 4.

表 1 外源MT對NaCl脅迫下扁穗雀麥根、苗的影響Table 1 Effect of exogenous melatonin on roots and seedlings of rescuegrass under NaCl stress

CK2處理下，苗高與苗鮮重較CK1處理時顯著降低(P ＜ 0.05)。無NaCl脅迫下，MT處理的苗高、苗鮮重與CK1相比變化趨勢和前述根長、根鮮重相似，分別在300、100 μmol·L-1MT時達到最大值。NaCl脅迫下，不同濃度MT處理的苗高、苗鮮重均較 CK2顯著上升 (P ＜ 0.05)，100 μmol·L-1MT 處理時苗高和苗鮮重達到最大值，分別為6.36 cm和0.121 g (表 1)。

不同處理下，扁穗雀麥4個表型性狀的變異系數(shù)范圍為16.20% (苗高)～53.70% (根鮮重)。其中，根長和根鮮重的變異幅度較大且變異系數(shù)在40%以上，表明相比于苗，根對不同處理的反應存在更大差異。

2.3.2 MT對扁穗雀麥根冠比的影響

CK2處理下，幼苗的根冠比與CK1處理相比增加了 27.13%(P ＜ 0.05） (圖 3)。無 NaCl脅迫下，50～500 μmol·L-1MT 處理種子時幼苗根冠比較 CK1處理 的增幅為 41.64%～ 51.54%， 其 中 500 μmol·L-1效果最顯著 (P ＜ 0.05)。NaCl脅迫下，100 μmol·L-1MT時根冠比較CK2和CK1處理分別增加了10.44%和 34.74%；添加 1 000 μmol·L-1MT 時根冠比下降至0.069，顯著低于 CK2和 CK1處理 (P ＜ 0.05)。

2.4 MT對扁穗雀麥幼苗生理指標的影響

圖 3 外源MT處理對NaCl脅迫下扁穗雀麥根冠比的影響Figure 3 Effect of exogenous melatonin treatment on shoot to root ratio of rescuegrass under NaCl treatment

CK2處理下，幼苗Pro含量和POD活性與CK1差異不顯著(圖4A、B)。無NaCl脅迫下，MT處理下幼苗的Pro含量和POD活性與CK2和CK1相比均隨MT濃度增加呈先上升后下降的趨勢，其中300、500 μmol·L-1的 MT 處理后幼苗中 Pro 含量和 POD活性達到最大值。NaCl脅迫下，100、300 μmol·L-1MT處理的幼苗Pro含量和POD活性達到最大值。

圖 4 外源MT處理對NaCl脅迫下扁穗雀麥幼苗生理指標的影響Figure 4 Effect of exogenous melatonin on physiological indexes of rescuegrass seedlings under NaCl stress

CK2處理下，幼苗MDA和可溶性蛋白含量較CK1顯著增加(圖4C、D)。無NaCl脅迫下，MT處理下幼苗可溶性蛋白與MDA含量較CK1均隨MT濃度增加呈先上升后下降的趨勢，分別在100和50 μmol·L-1MT時達到最大值。NaCl脅迫下，添加MT處理的幼苗可溶性蛋白含量與CK2相比亦隨MT濃度增加呈先上升后下降的趨勢，300 μmol·L-1MT處理時達到最大值；添加不同濃度MT處理的幼苗MDA含量較CK2處理均顯著下降(P ＜ 0.05)。

2.5 不同處理下扁穗雀麥抗鹽性的隸屬函數(shù)分析與綜合性評價

使用單一指標分析扁穗雀麥的抗鹽性具有片面性，采用隸屬函數(shù)計算得到的值為0～1區(qū)間內的純數(shù)，可以克服少數(shù)指標評價的不足，使各項指標具有可比性。再結合權重對每一處理各指標的隸屬函數(shù)值求和可對各處理進行綜合性評價。權重的計算借助主成分分析完成，即通過計算指標在各主成分線性組合中的系數(shù)和主成分的方差貢獻率，并進行指標權重的歸一化來算出各指標在各處理中所占權重。權重分析可得，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和苗鮮重貢獻率最大。隸屬函數(shù)綜合分析結果顯示，抗鹽性排序：CK2+ 100 μmol·L-1MT ＞ CK2+ 300 μmol·L-1MT ＞CK2+ 50 μmol·L-1MT ＞ CK2+ 500 μmol·L-1MT ＞ CK2+1 000 μmol·L-1MT ＞ CK2(表 2)， 即 添 加 濃 度 為100 μmol·L-1的外源 MT 時效果最好。

3 討論與結論

鹽脅迫是限制植物正常生長發(fā)育的環(huán)境因子之一[17]，鹽離子本身對植物造成的傷害為原初傷害，次生傷害則包括高鹽引起植物細胞缺水導致的滲透脅迫，以及高濃度Na+、Cl-對其他離子拮抗而導致植物對必要離子的吸收阻礙引起的營養(yǎng)脅迫[18]。本研究所用梯度濃度的NaCl降低了扁穗雀麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢并抑制了幼根幼苗的生長，同時鹽脅迫還增加了扁穗雀麥幼苗MDA的含量從而導致膜質過氧化。而在鹽脅迫下加入不同濃度的MT均能在一定程度上緩解鹽害，如，與單獨鹽脅迫相比，在其基礎上添加100 μmol·L-1的MT提高了扁穗雀麥的發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及幼苗中可溶性蛋白、游離脯氨酸(Pro)含量和過氧化物酶(POD)活性。

根系的發(fā)育、形態(tài)和活力對植物營養(yǎng)物質的吸收、新陳代謝及其生理功能有著重要影響，而根冠比則反映了植物地下部分與地上部分的相關性。有研究表明，外源添加MT可誘導植物中柱鞘細胞產(chǎn)生新的根原基，增加不定根的數(shù)量、長度以及側根數(shù)目[19]。本研究表明，鹽脅迫下根長、根鮮重、苗高和苗鮮重均下降，但根長和根鮮重的下降幅度小于苗高與苗鮮重，而在鹽脅迫下添加MT，根長和根鮮重的增加幅度大于苗高與苗鮮重，即在兩種處理方式下均表現(xiàn)為根冠比增加，這與添加MT對干旱脅迫下小麥(Triticum aestivum)[20]和櫻桃(Cerasus pseudocerasus)[21]作用的研究結果一致。

表 2 扁穗雀麥不同指標隸屬函數(shù)分析Table 2 Membership function analysis of different indexes of rescuegrass

細胞內膜質過氧化終產(chǎn)物為MDA，會引起蛋白質、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合并影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性，因此常用MDA含量的高低來衡量植物細胞膜質過氧化程度[22]。本研究表明，扁穗雀麥在受到鹽脅迫后MDA含量增加，這可能與OH-、H2O2等活性氧的大量積累有關。植物體內的保護系統(tǒng)能有效清除活性氧，而過氧化物酶(POD)作為體內重要的酶促系統(tǒng)之一，能通過分解H2O2以及某些酚類物質來保護植物細胞膜免受氧化傷害，對維持細胞內活性氧平衡、保護膜質結構和抵抗逆境脅迫有重要意義[23]。Pro和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節(jié)物質，Pro的積累與植物對逆境的耐受能力正相關，可溶性蛋白多是參與植物代謝的各種酶類，其含量是評價植物整體代謝水平的一個重要指標[19]。有研究表明，MT可以通過增加抗氧化酶相關基因的表達以及減少生物大分子的降解來提高POD活性，而增強對活性氧的清除能力[10]，這與本研究結果相符。

MT可以促進無逆境脅迫下植物幼根幼苗的生長，在提高植物產(chǎn)量上發(fā)揮作用[24]，而且在鹽脅迫下其在提高活性氧清除速率、維持滲透勢、降低膜質過氧化方面的效應更大。因此，在實際應用中，還應根據(jù)具體的生產(chǎn)條件，合理施用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下，添加100 μmol·L-1的 MT 能有效提高扁穗雀麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，促進幼根幼苗的生長，清除植物體內積累的活性氧，促進可溶性蛋白的合成，維持細胞滲透勢以及降低膜質過氧化程度等，這對于提高扁穗雀麥在鹽堿地等邊際土地上的生產(chǎn)效率具有一定的參考價值。