手性紫羅蘭酮生物堿衍生物Ion-31a的制備方法優(yōu)化

樊 曄 ，吳瀟然 ，聶江平 ，秦 楠 ，2，段宏泉 ，2

（1.天津醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究中心，天津300070）

惡性腫瘤是我國以及全球主要的公共健康問題，在我國腫瘤死亡約占全部死因的1/4[1]，根據(jù)國際癌癥研究中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2012年全球惡性腫瘤新發(fā)病例約1 409萬，死亡約820萬[2]，在惡性腫瘤中，乳腺癌是導致死亡的第二大腫瘤。在大量臨床病例中，腫瘤轉移是導致惡性腫瘤患者死亡的最主要原因，約90%惡性腫瘤患者的死亡原因與腫瘤轉移相關[3]。在轉移早期階段，乳腺癌細胞分泌蛋白水解酶，從而使它們從原發(fā)位點分離并退化細胞外基質，從而刺激癌細胞與多種方向反應而轉移，以促進腫瘤細胞的進程，在血液中循環(huán)后，癌細胞外滲入他們能存活和增殖的遠端器官而實現(xiàn)轉移[4-5]。本課題組前期在湖北省鄂西地區(qū)土家族常用民間藥材中發(fā)現(xiàn)轉筋草具有抗腫瘤轉移活性。轉筋草乙醇提取物分離提純后分離得到三萜、甾體、生物堿等各類成分，并對各類化合物進行抗腫瘤轉移的活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中生物堿化合物具有抗腫瘤轉移活性[6]，其中一類結構新穎的紫羅蘭酮生物堿對乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化、遷移、侵襲能力具有顯著抑制作用，對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的體外遷移及小管形成有明顯抑制作用[7]。以該化合物為先導化合物，經(jīng)過結構優(yōu)化得到了活性顯著提高的紫羅蘭酮生物堿衍生物Ion-31a（圖1），并發(fā)現(xiàn)此衍生物通過下調腫瘤細胞轉移相關的重要信號分子整合素-β（intergrinβ）、蛋白激酶 C-ξ（PKCξ）的磷酸化水平而發(fā)揮抗腫瘤轉移作用[8]。化合物Ion-31a活性突出，具有非常好的新藥開發(fā)價值，但原文獻報道的合成路線復雜，產率很低，本文通過建立新的合成路線，優(yōu)化反應條件以得到提高Ion-31a的總收率，同時保證其良好的光學純度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵；W201恒溫浴鍋；低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科儀器設備有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；Advance III 400M核磁共振儀（Bruker公司，TMS為內標）；DZX-3型真空干燥箱；ZF-I型三用紫外分析儀；EYELA PSL-1810型低溫反應器；KQ-500B超聲波清洗器；青島海洋高效薄層層析硅膠板 GF254（200 mm×200 mm）；202電熱恒溫干燥箱；N-1100旋轉蒸發(fā)儀。α-紫羅蘭酮純度為99%，購買于希爾貝思（天津）科技有限公司；柱色譜和薄層色譜用硅膠均系青島海洋化工廠生產，所用試劑均為分析純；氘代試劑ALDRICH公司生產。

1.2 優(yōu)化后的Ion-31a的合成工藝 見圖1。

圖1 化合物Ion-31a的合成路線Fig 1 Synthetic route of compound Ion-31a

1.3 化合物合成方法

1.3.1 化合物4的合成 取1當量化合物3于反應瓶中，加入適量甲基叔丁基醚溶解，再加入1當量洋蔥假單胞菌脂肪酶（pseudomonas cepacia）和12當量醋酸乙烯酯。之后將反應瓶于40℃油浴條件下攪拌 1 周，TLC 監(jiān)測反應完全（PE：EA=4∶1，V/V)。將反應液離心，取上清液旋干得粗品，然后將粗產品經(jīng)硅膠柱色譜（PE∶EA=10∶1，V/V）得化合物 4。

1.3.2 化合物6的合成 取1當量化合物5粗品置于反應瓶中，用適量乙酸溶解，在室溫下加入1.1當量鋅粉和3當量乙酸鈉，攪拌5 min后加入2當量碘化鈉，室溫反應過夜，TLC監(jiān)測反應完全（PE：EA=10：1，V/V）。將反應液用少量EA稀釋，用飽和碳酸氫鈉溶液將pH調至中性，再用EA萃取，收集有機相加入無水硫酸鎂干燥，旋干，得到化合物粗品，然后將粗產品經(jīng)硅膠柱色譜（PE∶EA=25∶1，V/V），得化合物6。

1.3.3 化合物10的合成 取1當量化合物9于反應瓶中，用THF溶解，加雷尼鎳混合物（50%在水中）氫氣置換后，向反應瓶中持續(xù)通入氫氣在室溫下攪拌 1 h，TLC 監(jiān)測反應完全（PE∶EA=3∶2，V/V）。反應完成后，將反應液用硅藻土抽濾，旋干，即得化合物10。

1.3.4 化合物11的合成 稱取4當量四氫鋁鋰于反應瓶中，加入無水四氫呋喃，氮氣保護于冰浴下攪拌，緩慢滴加1當量化合物10的無水四氫呋喃溶液，將反應液升溫至30℃攪拌24 h。TLC監(jiān)測反應完全（PE：EA=1∶1，V/V）。冰浴下緩慢滴加加入蒸餾水，4 mol/L氫氧化鈉水溶液，反應液變成乳白色混懸液后，抽濾，濃縮濾液得粗品11。

1.3.5Ion-31a的合成 稱取1當量化合物12于反應瓶中，用適量二氯甲烷使其溶解，加入1.5當量無水碳酸鉀和1當量3-氟溴芐，在室溫下攪拌20min后，TLC 監(jiān)測反應完全（PE：EA：二乙胺=5：1：1，V/V）。濃縮溶劑得粗品，粗品經(jīng)硅膠柱色譜（PE：EA=3：1，V/V）得Ion-31a。

2 結果

2.1 關鍵化合物的結構表征

2.1.1 化合物7的結構表征 黃色油狀物，產率為28.8%。1H NMR（400MHz,CDCl3），δ6.61(dd，J=15.2 Hz，10.0 Hz，1H),6.03 (dd,J=15.2 Hz,6.1 Hz,1H),5.50(m,1H),2.34(s,3H),2.02(m,2H),1.61(m,3H),1.45(m,1H),1.13(m,1H),0.80(s,3H),0.72(s,3H).13CNMR(100MHz,CDCl3)：δ149.1,132.7,59.6,59.1,52.1,30.8,28.9,28.1,27.0,23.9,21.9,21.4,20.4.

2.1.2 化合物8的結構表征 黃色油狀物，產率為80%。1HNMR(400MHz,CDCl3),δ6.92(dd,J=15.2Hz,9.8Hz,1H),5.81(d,J=15.2Hz,1H),5.50(br s,1H),2.31(d,J=9.8Hz,1H),2.04(br s,2H),1.57(s,3H),1.47(m,1H),1.21(m,1H),0.93(s,3H),0.86(s,3H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)：δ171.4,152.9,131.6,122.8,121.5,54.1,32.5,31.1,27.7,26.8,23.0,22.8.

2.1.3 化合物9的結構表征 黃色油狀物，產率為72%。1HNMR(400MHz,CDCl3),δ6.64(dd,J=15.2Hz,9.7Hz,1H),6.61(br s,1H)5.83(d,J=15.2Hz,1H),5.45(br s,1H),2.85(d,J=4.8Hz,3H),2.23(d,J=9.7Hz,1H),2.01(br s,2H),1.55(s,3H),1.46(m,1H),1.18(m,1H),0.90(s,3H),0.84(s,3H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)：δ166.8,144.6,132.3,124.8,122.1,53.8,32.3,31.2,27.6,26.8,26.2,23.0,22.8.

2.1.4 化合物10的結構表征 黃色油狀物，產率為 95%。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ5.47(br s,1H),5.33(m,1H),2.80(s,3H),2.21(t,2H),2.0-1.85(m,3H),1.68(s,3H),1.48(m,2H),1.45-1.10(m,2H),0.93(s,3H),0.87(s,3H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)：δ173.8,135.6,120.9,48.7,36.7,32.6,31.5,27.6,27.5,26.6,26.2,23.5,23.0.與文獻報道[9]一致。

2.1.5Ion-31a的結構表征 黃色油狀物，產率為52.1%。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.25(m,1H,Ar-H),7.04(m,2H,Ar-H),6.92(m,1H,Ar-H),5.81(br s,1H),3.45(br s,2H),2.36(d,J=17.2Hz,1H),2.33(m,2H),2.17(s,3H),2.02(d,J=17.2Hz,1H),1.97(s,3H),1.84(m,1H),1.71(m,1H),1.57(m,2H),1.41(m,1H),1.04(s,3H),1.00(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ199.4,165.6,163.0(d,J=243.7Hz),142.0(d,J=6.9Hz),129.6(d,J=8.1Hz),125.1,124.3(d,J=2.7Hz),115.6(d,J=21.1Hz),113.8(d,J=21.1Hz),62.0,57.7,51.2,47.2,42.3,36.3,28.8,27.9,27.3,27.2,24.7.

2.2 目標化合物制備方法優(yōu)化 關鍵中間體8的制備方法優(yōu)化結果見表1。目標產物Ion-31a的制備方法優(yōu)化結果見表2。

表1 不同拆分方法可得到中間體8的收率Yield of intermediate 8 obtained by different resolution methods

表2 不同溶劑對最后一步制備Ion-31a的產率影響Tab 2 Effects of different solvents on the yield of Ion-31a prepared in the last step

3 討論

中間體8是整個路線合成的重要光學中間體，而對其合成方法的優(yōu)化是Ion-31a合成路線優(yōu)化的主要工作?；衔?合成的關鍵步驟是對外消旋原料進行拆分以得到單一手性的中間體。原路線是由消旋α-紫羅蘭酮合成化合物8的外消旋體，再與（R）-（+）-1-苯乙胺成鹽后使用結晶法對其進行拆分，得到R構型的中間體8。這也是分離手性化合物最經(jīng)典、最常用的方法，廣泛應用于大多數(shù)手性藥物制備。其原理是外消旋體的化學性質使其與某一光學拆分劑反應以生成兩種非對映體的鹽，然后利用兩者之間的溶解度和結晶速率的差異，通過結晶法進行分離，最后再脫去拆分劑，即得到單一構型的異構體。由于本文所需關鍵中間體8為油狀物，結晶性較差，這可能在很大程度上限制了應用結晶法對其進行拆分，實際操作中發(fā)現(xiàn)，需對其進行成鹽結晶操作，且得到的產物光學純度不高，拆分損失較大，是影響目標化合物Ion-31a總產率的最主要原因。

根據(jù)文獻報道，通過酶促拆分法，利用洋蔥假單胞菌脂肪酶對仲羥基的選擇性乙酰化，可得到光學純的R構型α-紫羅蘭酮類化合物[10]。如表1所示，由于酶促反應具有高度的立體選擇性，使用酶催化的該步反應得到的產物光學純度較高且可大量制備。使用酶催化反應合成單一構型化合物，再經(jīng)簡單的水解、氧化、鹵仿反應得到高光學純度的R構型化合物8。此步驟之后所有反應均不涉及化合物6位手性中心，因此該手性碳不會發(fā)生構型改變，不影響目標產物Ion-31a的光學純度。因此，酶促拆分法較結晶拆分法獲得中間體8優(yōu)勢明顯，產率顯著提高。

原文獻報道的化合物11合成方法是使用四氫鋁鋰直接對化合物9的共軛不飽和酰胺進行還原得到化合物11。在進行還原反應時除生成目標化合物11以后，還會得到雙鍵未被還原的副產物，這使得此反應產率較低，產物只有40%。

針對該反應的副產物情況，我們嘗試分步還原，即先用雷尼鎳催化氫化反應還原共軛不飽和酰胺的雙鍵得到中間體10[11-12]，再進行酰胺還原得到中間體11，該方法與原方法相比產率直接提高了30%。