截肢手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)大鼠心臟電生理、心功能及eNOS通路的影響

趙桂香，劉志強(qiáng)，古麗扎爾·吐?tīng)栠d

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，烏魯木齊 830002； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)管內(nèi)科，烏魯木齊 830054； 3.新疆喀什疏勒縣解放軍第947醫(yī)院特診科，新疆 喀什 844200)

截肢創(chuàng)傷屬于特殊類型的創(chuàng)傷，手術(shù)前、后機(jī)體會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),且延續(xù)至術(shù)后，損傷害患者身體健康，其中心血管系統(tǒng)是截肢創(chuàng)傷應(yīng)激作用的重要靶器官[1]。創(chuàng)傷后機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、Ca離子超載，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈供血不足、心律失常、心功能受損等[2]。調(diào)查顯示[3]，30%術(shù)后并發(fā)癥、50%術(shù)后死亡原因均為圍術(shù)期心血管事件，因此探究截肢創(chuàng)傷心功能變化情況對(duì)于臨床治療、預(yù)防圍術(shù)期心血管事件，提高患者預(yù)后具有積極的意義。eNOS/NO通路在維持血管舒張、白細(xì)胞黏附以及抑制血小板凝集中發(fā)揮重要作用，多項(xiàng)研究指出該通路激活后對(duì)心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用[4-5]，然而eNOS/NO通路與截肢創(chuàng)傷后心功能的關(guān)系，目前尚不清楚，本研究通過(guò)復(fù)制左后肢截肢創(chuàng)傷模型，觀察大鼠心臟電生理、心功能變化情況，并初步探究作用機(jī)制，以期為截肢創(chuàng)傷后心血管系統(tǒng)機(jī)制研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究室，[SCXK2015-0001][SYXK(新)2016-0008]。嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理，倫理審批號(hào)：IACUC20170005，統(tǒng)一在溫度25℃，濕度50%～60%，自然光照條件下喂養(yǎng)，期間大鼠自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)1周后用于研究。

1.2 主要試劑與儀器

髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測(cè)試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：A002097)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A003-1、A001-3)；一氧化氮(NO)含量檢測(cè)試劑盒(北京Solarbio公司；貨號(hào)：BC1475)；腫瘤壞死因子-ɑ (tumor necrosis factor-ɑ, TNF-ɑ)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、蘇木精—伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE) 染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：P5318、PI326、C0105)；Tunel染色試劑盒(Roche公司，瑞士，貨號(hào)：11684817910)；RIPA組織裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：P0013C)；B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白 (Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(R&D公司，美國(guó)，貨號(hào)：AF810，AF820)；eNOS、β-actin一抗(CST，美國(guó)，貨號(hào)：9572、4967)；MP-150型生理信號(hào)采集系統(tǒng)(Biopac，美國(guó))；VEVO3100小動(dòng)物超聲檢測(cè)儀(VisualSonics，加拿大)；ChemiDox XRS型凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))；XSP-BM21AY熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備[6]

采用3%異戊巴比妥鈉以80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，采取仰臥位，切開(kāi)左側(cè)腹股溝皮膚，游離股動(dòng)靜脈，于腹壁牽動(dòng)靜脈結(jié)扎，在膝關(guān)節(jié)上方1.3 cm處將股靜脈與股動(dòng)脈之外其它結(jié)構(gòu)完全切除，最終將股靜脈與股動(dòng)脈剪斷，復(fù)制左后肢創(chuàng)傷模型。

1.3.2 動(dòng)物分組

將大鼠分為正常組(僅麻醉不進(jìn)行截肢處理)，截肢對(duì)照組、截肢0.25 h、截肢0.5 h、截肢0.75 h、截肢1.5 h，每組12只大鼠。

1.3.3 大鼠心電圖(electrocardiogram，ECG)檢測(cè)

用3%異戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉大鼠后，利用生理信號(hào)采集系統(tǒng)行ECG檢測(cè),于皮下插入針型電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖，頻率設(shè)定為10 kHz，掃描速率設(shè)定為200 ms，觀察心率、QT間期、PR間期變化情況。

1.3.4 超聲檢測(cè)左心室功能

3%異戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，利用彩色多普勒超聲檢測(cè)儀，獲取左心室長(zhǎng)軸切面二維圖像，對(duì)大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS),連續(xù)檢測(cè)至少3個(gè)完整心動(dòng)周期，求得平均值。

1.3.5 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

大鼠麻醉后，迅速將右頸總動(dòng)脈分離，于遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，右側(cè)頸動(dòng)脈插管用40 U/mL肝素生理鹽水浸潤(rùn)導(dǎo)管，觀察壓力曲線，待曲線呈正弦波形穩(wěn)定10 min后檢測(cè)左心室收縮壓(Leftventeicular Left venteicular systolic pressuere，LVSP)，左心室內(nèi)壓降低最高速率(+dp/dt max)以及左心室內(nèi)壓降低最高速率(-dp/dtmax)。

1.3.6 樣本采集

采集各組大鼠尾靜脈血，3000 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。采集尾靜脈血后，麻醉處死，迅速獲取左心室心肌，將外膜脂肪除去后，一部分置于-80℃保存；一部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.3.7 指標(biāo)檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)血清和心肌組織中MPO、MDA、SOD、NO、TNF-ɑ、IL-6水平。MPO活性：1 g心肌組織濕片在37℃環(huán)境中被分解1 μmol過(guò)氧化氫為1 U/g。MDA采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法。SOD水平采用鄰苯三酚比色法；NO水采用Green法[7]；TNF-ɑ和IL-6采用酶聯(lián)免疫吸附法。

1.3.8 HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化

常規(guī)制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水后，進(jìn)行蘇木精染色，10 min后水洗后，0.5%鹽酸乙醇中分化后水洗，氨水中顯藍(lán)30 s后水洗，伊紅染液復(fù)染2 min，水洗后梯度乙醇水合、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片后，置于顯微鏡下觀察心肌組織變化情況。

1.3.9 末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡

常規(guī)制備石蠟切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光，觀察并保存圖片，采用Image-J軟件定量分析細(xì)胞凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=細(xì)胞凋亡數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.10 蛋白免疫印跡法檢測(cè)心肌組織eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

取出凍存心肌組織，采用RIPA組織裂解液提取蛋白，離心后，采用BCA法檢測(cè)蛋白含量，采用SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，將蛋白凝膠移至PVDF膜上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，脫脂牛奶封閉后添加eNOS、Bcl-2、Bax、β-actin一抗抗體(稀釋倍數(shù)為1∶500)，4℃過(guò)夜孵育，添加HRP標(biāo)記二抗(稀釋倍數(shù)為1∶5000)，室溫下孵育2 h，采用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，于凝膠成像儀中觀察條帶，將β-actin為內(nèi)參蛋白，用Image Pro-Plus軟件定量分析相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 截肢手術(shù)后大鼠ECG變化情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h大鼠心率、QT間期、PR間期無(wú)顯著變化，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；截肢后0.5 h，截肢后0.75 h心率逐漸升高、QT間期、PR間期逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h心率降低，QT間期、PR間期升高，差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 截肢后大鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h大鼠LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS 無(wú)顯著變化，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；截肢后0.5 h，截肢后0.75 h LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS升高，差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 截肢后大鼠血清中氧化應(yīng)激、炎癥水平變化情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.75 h大鼠血清MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后1.5 h MPO、MDA、TNF-ɑ、IL-6升高，SOD降低，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果如圖1所示。

2.4 截肢后大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激、炎癥水平變化情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h大鼠MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6升高(P<0.05)，SOD降低(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h MPO、MDA、、TNF-ɑ、IL-6降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)。結(jié)果如圖2所示。

2.5 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

正常組心肌組織染色均勻,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊,未出現(xiàn)明顯病理性改變；截肢后0～0.75 h，細(xì)胞排列疏松，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞呈破碎、壞死狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌組織病理?yè)p傷程度加重。截肢后1.5 h后心肌病理?yè)p傷程度有所減輕。結(jié)果如圖3所示。

2.6 各組大鼠心肌組織凋亡情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果如圖4和圖5所示。

表1 各組大鼠EGG檢測(cè)結(jié)果比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group.*P< 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group,#P< 0.05.

表2 各組大鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。

Note：Compared with the normal group.*P< 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group,#P< 0.05.

注： A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對(duì)照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。與正常組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠serum鼠MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6水平比較Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively. Compared with the normal group, *P < 0.05.Figure 1 Comparison of the MPO, MDA, SOD, TNF- and IL-6 levels in the rat myocardium in each group

注：A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對(duì)照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠心肌組織中MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6水平比較Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively.Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group. #P< 0.05.Figure 2 Comparison of MPO, MDA, SOD, TNF-ɑ and IL-6 levels in myocardium of the rats in each group

圖3 各組大鼠心肌組織的病理學(xué)變化。HE染色。Figure 3 Histological changes of myocardial tissues in the rats. HE staining

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡狀況，TUNEL染色Figure 4 Apoptosis in cardiomyoaytes cells in the rats of each group. TUNEL staining.

注：與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較Note. Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 5 Comparison of the apoptotic indexes of cardiomyocytes in the rats of different groups

2.7 心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低、Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果如圖6和圖7所示。

注：A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對(duì)照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。圖6 Western blot檢測(cè)心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively.Figure 6 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the rat myocardial tissues. Western blot.

2.8 各組心肌組織中eNOS/NO水平變化情況

與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h心肌組織中eNOS 蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中eNOS 蛋白表達(dá)逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢1.5 h eNOS 蛋白表達(dá)升高，差異顯著(P<0.05)；與正常組相比，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.25 h組織中NO水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中NO水平逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h NO水平升高，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果如圖 8所示。

3 討論

截肢手術(shù)造成的創(chuàng)傷不但會(huì)損傷手術(shù)部位肢體，而且對(duì)機(jī)體重要器官如心、肝、肺等均會(huì)有一定程度的損傷?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)截肢創(chuàng)傷大鼠心肌組織染色后組織伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡提示心肌線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，且峭斷裂，表明截肢創(chuàng)傷也會(huì)造成心臟損害，這可能是創(chuàng)傷后患者發(fā)生心律失常以及心功能障礙、心源性猝死的重要原因[8]。報(bào)道顯示心律失常在圍手術(shù)期并發(fā)癥中發(fā)生率為10%～60%[9]。目前截肢術(shù)后心功能損害的發(fā)生機(jī)制以及治療方法尚不明確。因此本研究通過(guò)探究截肢手術(shù)后大鼠電生理、心臟功能損傷情況，并初步闡明截肢創(chuàng)傷后心肌損傷的作用機(jī)理。

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。圖7 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較Note.Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 7 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax proteins in the rat myocardial tissues of each group

肢體創(chuàng)傷后可使局部組織通透性升高、血管內(nèi)皮損傷引發(fā)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)與炎癥反應(yīng)，且效應(yīng)可達(dá)心臟，引發(fā)心律失常、心肌缺血、心臟功能受損等疾病[10]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，截肢手術(shù)后0～0.75 h內(nèi)大鼠心率加快，PR間期、QT間期縮短，提示大鼠截肢創(chuàng)傷后心電圖表現(xiàn)異常。LVSP為評(píng)估心肌收縮射血能力的主要指標(biāo)，+dp/dmax、-dp/dmax為評(píng)估心肌收縮、舒張功能的主要指標(biāo)，LVFS、LVEF均是評(píng)估左心室收縮能力的指標(biāo)，以往研究顯示LVSP、LVFS、LVEF三者水平的下降均表明左心室收縮能力的降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)截肢后大鼠LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS水平均降低，且術(shù)后0.75 h降至最低，1.5 h水平升高，提示截肢手術(shù)會(huì)影響大鼠左心室功能，造成左心室舒張、收縮功能降低。本研究進(jìn)一步通過(guò)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)截肢后0～0.75 h，心肌細(xì)胞排列疏松，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞呈破碎、壞死狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌組織病理?yè)p傷程度加重，1.5 h后心肌病理?yè)p傷程度有所減輕，提示截肢后心肌組織出現(xiàn)病理性損傷，進(jìn)而造成心室功能損傷。

注：與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖8 各組心肌組織中eNOS和NO水平比較Note. Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 8 Comparison of eNOS and NO levels in the rat myocardial tissues of each group

正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)自由基的合成與清除均處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)受到病理性損傷后，機(jī)體中超氧負(fù)離子、羥自由基釋放過(guò)多，造成膜磷脂、蛋白等氧化反應(yīng)加劇，生成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，損傷細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞代謝功能受到障礙。MDA為機(jī)體中脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物，因此其水平的高低能夠反應(yīng)組織自由基水平或細(xì)胞損傷程度。基礎(chǔ)研究顯示近期較多研究證實(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化及自由基生成過(guò)多是心肌組織損傷的重要原因，心肌組織受損后，組織中自由基過(guò)多無(wú)法及時(shí)清除,影響心肌細(xì)胞的呼吸作用，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后0～0.75 h心肌組織中MDA升高，SOD降低，在第0.75 h均達(dá)到最高值，1.5 h后MDA降低，SOD水平升高，而通過(guò)分析本研究大鼠血清中氧化應(yīng)激、炎癥水平變化情況結(jié)果顯示，截肢對(duì)照組、截肢時(shí)及截肢后0.75 h大鼠血清MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無(wú)顯著變化；截肢1.5 h MPO、MDA、TNF-ɑ、IL-6升高，SOD降低，此結(jié)果與心肌組織氧化應(yīng)激損傷結(jié)果有一定的差異，血清中各檢測(cè)指標(biāo)在1.5 h開(kāi)始顯著變化，而心肌組織在0.75 h開(kāi)始顯著變化。與心肌組織相比，血清中各檢測(cè)指標(biāo)變化時(shí)間延遲，由此可以說(shuō)明心肌組織氧化應(yīng)激損傷不是由于截肢部位釋放的，提示截肢創(chuàng)傷后會(huì)造成心肌組織氧化應(yīng)激損傷，可能是造成截肢創(chuàng)傷后心肌損傷的重要病理學(xué)原因。同時(shí)也就一步說(shuō)明創(chuàng)傷后器官損傷會(huì)造成炎癥反應(yīng)失控，血管內(nèi)皮釋放較多黏附因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集、黏附，進(jìn)一步釋放大量TNF-ɑ、IL-6等炎性因子，損害組織器官[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)截肢創(chuàng)傷后心肌組織中0～0.75 h Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，隨后在1.5 h Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，提示截肢創(chuàng)傷后心肌組織中炎癥因子水平升高，造成炎性損傷，與HE染色結(jié)果相符合，提示心肌炎性損傷可能為截肢創(chuàng)傷后心肌手段的重要原因。

心肌組織損傷后可引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重病理?yè)p傷，本研究采用TUNEL染色顯示，與正常組相比截肢0.75 h內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高，1.5 h后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，提示截肢后可引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，這可能為導(dǎo)致心肌損傷的重要原因。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2，細(xì)胞正常狀況下，Bcl-2、Bcl-XL、Bax以二聚體形式存在于線粒體內(nèi)以阻礙細(xì)胞凋亡；細(xì)胞損傷后，Bax蛋白大量表達(dá)聚集于線粒體膜上，導(dǎo)致膜通透性增加，促使凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活caspase通路引發(fā)細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)截肢創(chuàng)傷后心肌組織中0～0.75 h MPO、TNF-ɑ、IL-6水平逐漸升高，在第0.75 h均達(dá)到最高值，隨后在1.5 h水平降低，提示截肢創(chuàng)傷后心肌組織中炎癥因子水平升高，造成炎性損傷，與HE染色結(jié)果相符合，提示心肌炎性損傷可能為截肢創(chuàng)傷后心肌手段的重要原因。

NO是由eNOS催化精氨酸生成，在血管擴(kuò)張中發(fā)生重要作用,在心肌損傷時(shí)時(shí)其水平的升高可抑制心室重構(gòu)。以往研究顯示內(nèi)源性NO水平的降低導(dǎo)致血管舒張功能減弱，加重心肌損傷,而內(nèi)源性NO水平與eNOS的活性密切有關(guān),eNOS活性減弱則會(huì)導(dǎo)致NO釋放減少，促進(jìn)心力衰竭[18]。在動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)對(duì)激活eNOS/NO信號(hào)傳導(dǎo)，可降低心肌梗死面積減輕心臟重構(gòu)不良，因此激活eNOS/NO信號(hào)可抑制心肌梗死所致心臟重構(gòu)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)截肢創(chuàng)傷后0.75 h內(nèi)NO水平、eNOS蛋白表達(dá)降低，截肢1.5 h NO水平、eNOS蛋白表達(dá)升高，提示eNOS/NO信號(hào)通路受抑與截肢后心肌損傷有關(guān)。

綜上所述，截肢手術(shù)創(chuàng)傷后影響大鼠電生理、心功能，使大鼠發(fā)生缺血性心電圖改變，心功能受損，引發(fā)心肌組織過(guò)度氧化應(yīng)激、炎癥損傷，其機(jī)制可能與eNOS/NO通路受到抑制有關(guān)，截肢手術(shù)創(chuàng)傷后心肌組織損傷機(jī)制較復(fù)雜，涉及較多信號(hào)通路，本研究?jī)H對(duì)eNOS/NO通路變化情況進(jìn)行研究，有關(guān)確切機(jī)制還有待后續(xù)深入探究。