利用生物信息學(xué)、免疫組化分析腫瘤來(lái)源免疫球蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

王國(guó)輝 楊雄濤 朱廣迎

肺癌已經(jīng)成為全球惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的首要原因。據(jù)預(yù)測(cè)，2018年有180萬(wàn)肺癌患者死亡，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的近1/5（18.4%）[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的83%，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌。75%的NSCLC患者診斷時(shí)已處于中晚期，治療方式主要有手術(shù)、放化療、靶向治療以及免疫治療，但是其5年生存率仍然低于30%[2]。因此，需要進(jìn)一步研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制，以改進(jìn)其現(xiàn)有的臨床診療現(xiàn)狀。

經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為，免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）是免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶B細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生、可以與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，是體液免疫的重要效應(yīng)分子。然而我國(guó)學(xué)者邱曉彥教授在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)非B細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞也可以合成和分泌IgG，稱(chēng)為腫瘤來(lái)源免疫球蛋白（cancer-IgG）[3]，并發(fā)現(xiàn)cancer-IgG在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[4-9]。這一區(qū)別于經(jīng)典免疫學(xué)理論的觀點(diǎn)，得到了越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。Lee等[10]利用卵巢癌細(xì)胞系OC-3-VGH的裂解產(chǎn)物去免疫小鼠，得到了一株單克隆抗體RP215，通過(guò)識(shí)別IgG重鏈恒定區(qū)的一個(gè)特殊糖基化位點(diǎn)，可以特異性地識(shí)別cancer-IgG。Liao等[9]發(fā)現(xiàn)，RP215識(shí)別的cancer-IgG促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且可以作為一個(gè)潛在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[4]。Tang等的研究也表明，RP215識(shí)別的cancer-IgG是通過(guò)其特殊的糖基化表位激活黏著斑通路來(lái)促進(jìn)肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展。IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，每條重鏈和輕鏈都由可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成。IgG1重鏈恒定區(qū)的編碼基因（immunoglobulin heavy constant gamma 1, IGHG1）的表達(dá)量與cancer-IgG的表達(dá)量呈正相關(guān)[11]。已有研究[6,7,12-15]表明，IGHG1在膀胱癌、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等處于高表達(dá)的狀態(tài)，其與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤免疫逃逸相關(guān)。

本研究利用生物信息學(xué)和免疫組化的方法，分析cancer-IgG在NSCLC中的表達(dá)情況與預(yù)后生存以及臨床病例特征的關(guān)系。采用基因富集分析方法（gene set enrichment analysis, GSEA），分析IGHG1高表達(dá)樣本所富集到的信號(hào)通路，初步探討cancer-IgG參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析在基因表達(dá)匯編（gene expression omnibus, GEO） 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載NSCLC相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE30219[16]、GSE33532和GSE37745[17]的原始數(shù)據(jù)，采用穩(wěn)健多芯片平均標(biāo)準(zhǔn)化（RAM）方法對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（圖1）。以IGHG1表達(dá)值的中位數(shù)為分組依據(jù)，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。利用GSE33532數(shù)據(jù)集，比較NSCLC與正常組織中IGHG1表達(dá)差異；通過(guò)基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析在線(xiàn)網(wǎng)站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）[18]分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中IGHG1在LUAD和LUSC中的表達(dá)情況；運(yùn)用GSE30219數(shù)據(jù)集中的生存信息，依據(jù)IGHG1的表達(dá)量，繪制生存曲線(xiàn)。利用Kaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis）[19]中的肺癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線(xiàn)生存分析。數(shù)據(jù)集GSE37745中的組織樣本依據(jù)IGHG1表達(dá)量的中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組采用GSEA3.0版本進(jìn)行基因富集分析（http://software.broadinsitute.org/gsea/index.jsp）[20]。從GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取c2.cp.kegg.v6.2基因集為參照基因，按照默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行富集分析。每次分析重復(fù)1,000次。

1.2 肺癌組織芯片及免疫組織化學(xué)染色肺癌組織芯片 購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，所有患者經(jīng)病理確診為肺癌，收集性別、年齡、病理分級(jí)、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）第7版TNM分期等臨床病理資料（表1）。

組織芯片置于二甲苯脫蠟20 min，更換新鮮二甲苯重復(fù)1次。將脫蠟后的芯片于100%乙醇中浸泡5 min 2次，95%乙醇、80%乙醇、蒸餾水各浸泡5 min。堿性抗原修復(fù)液（Tris-EDTA, pH=9）用高壓鍋加熱至沸騰，將芯片放入，計(jì)時(shí)2 min，自然冷卻至室溫。3%H2O2室溫下避光孵育10 min，用正常羊血清工作液室溫封閉30 min。隨后加入一抗RP215，4 ℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。RP215單克隆抗體由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部邱曉彥課題組饋贈(zèng)，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自于Cell Signaling Technology。

1.3 免疫組織化學(xué)染色判定每張切片 隨機(jī)選取10個(gè)高倍（400×）視野，由兩名病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片。細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分利用四個(gè)強(qiáng)度等級(jí)（0：陰性，1：弱陽(yáng)性，2：中度陽(yáng)性，3：強(qiáng)陽(yáng)性）以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比等級(jí)（0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-25%, 3:26%-50%, 4: 51%-100%）。最終的評(píng)分為強(qiáng)度等級(jí)和陽(yáng)性細(xì)胞率（百分比）等級(jí)的乘積，0-3為低表達(dá)，4-9為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組織中cancer-IgG表達(dá)水平的比較采用χ2檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，與臨床病理特征分析采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法并行Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GSEA分析中，以P＜0.05及FDR＜0.25的基因集作為顯著富集的基因集。

2 結(jié)果

2.1 IGHG1在NSCLC中的表達(dá)與臨床預(yù)后之間的關(guān)系 在GSE33532數(shù)據(jù)集中，IGHG1在NSCLC中的表達(dá)水平為（6.635±0.125），正常肺組織的表達(dá)水平為（4.965±0.141），NSCLC中的表達(dá)量顯著高于正常肺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2A）。分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的LUAD和LUSC的數(shù)據(jù)，也得到了同樣的結(jié)論：IGHG1在NSCLC中的表達(dá)量顯著高于正常組織（P＜0.01）（圖2B）。分析GSE30219數(shù)據(jù)集中NSCLC患者的生存信息，IGHG1高表達(dá)組的總生存期較低表達(dá)組患者顯著縮短（P=0.008, HR=1.632, 95%CI: 1.138-2.314）（圖2C）。再利用KM-plotter（http://kmplot.com/analysis）數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析IGHG1與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，也得出了相似的結(jié)論，高表達(dá)IGHG1組的患者預(yù)后差于低表達(dá)組（P=3.4e-05, HR=1.4, 95%CI:1.19-1.64）（圖2D）。

2.2 Cancer-IgG在NSCLC中的表達(dá)與臨床病例特征及預(yù)后的相關(guān)性 如圖3（A-D）所示，Cancer-IgG在胞膜、胞質(zhì)和核膜上均有表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈巢狀排列，在NSCLC中的陽(yáng)性率為81.9%（59/72）。如表1所示，依據(jù)cancer-Ig G表達(dá)量的高低，進(jìn)一步對(duì)該7 2例NSCLC患者的臨床病例特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：cancer-IgG與NSCLC患者的臨床分期（P=0.042）、T分期（P=0.044）和轉(zhuǎn)移（P=0.007）相關(guān)。生存分析顯示，高表達(dá)cancer-IgG組中的總生存期顯著低于低表達(dá)組（P=0.008,HR=1.746, 95%CI: 1.39-1.94）。

2.3 IGHG1的功能基因富集選用GSE37745數(shù)據(jù)集，運(yùn)用GSEA分析方法分析IGHG1表達(dá)水平對(duì)調(diào)控基因集富集的影響。結(jié)果顯示IGHG1高表達(dá)的腫瘤樣本可以富集在細(xì)胞黏附（NES=1.654、NOMP=0.007、F D Rq=0.0 8 5）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用（NES=1.690、NOMP=0.001、FDRq=0.075）和趨化因子信號(hào)通路（NES=1.564、NOMP=0.019、FDRq=0.125）（圖4）。

3 討論

目前，經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為IgG僅由B淋巴細(xì)胞合成和分泌，是體液免疫的重要效應(yīng)分子。IgG是由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈構(gòu)成的Y形分子，輕鏈和重鏈之間以二硫鍵連接。每條重鏈和輕鏈都是由恒定區(qū)和可變區(qū)構(gòu)成，可變區(qū)是由若干個(gè)基因片段所編碼，包括可變段（V區(qū)）、多樣段（D區(qū)）和連接段（J區(qū)）[21]。B淋巴細(xì)胞通過(guò)重排V、D和J基因片段，產(chǎn)生IgG的可變區(qū)。由于每段可變區(qū)基因都有不同的拷貝，各段之間還存在不同的組合方式，因此IgG的可變區(qū)可以發(fā)生數(shù)量巨大的變化，與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)揮抗體的功能[22]。我國(guó)學(xué)者邱曉彥教授在國(guó)際上率先發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞也可以產(chǎn)生IgG，其結(jié)構(gòu)與B淋巴細(xì)胞分泌的IgG最大的不同就是可變區(qū)呈現(xiàn)相對(duì)固定的重排模式。λ鏈的可變區(qū)主要呈現(xiàn)VH5-51/D3-9/JH4、VH3-30/D6-19/JH4兩種重排模式，μ鏈的可變區(qū)主要呈現(xiàn)VH3-15/D3-10/JH4、VH6-1/D6-13/JH4和VH4-30-2/D3-22/JH4三種重排模式[23]。

Cancer-IgG在功能方面與B細(xì)胞來(lái)源的IgG也有很大的區(qū)別。Liao[4]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中cancer-IgG與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)cancer-IgG的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征。Liu[13]發(fā)現(xiàn)IgG1重鏈編碼基因IGHG1在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常前列腺組織，并且與前列腺癌的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。顧江[11]等的研究證明了IGHG1與cancer-IgG的表達(dá)量呈正相關(guān)。本研究在GEO、TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)IGHG1在NSCLC中的表達(dá)量顯著高于正常肺組織，并且高表達(dá)IGHG1的NSCLC患者預(yù)后較差。目前商業(yè)化的抗IgG1抗體是用人外周血提取的IgG做為免疫原獲得的，不能區(qū)分B細(xì)胞來(lái)源的及腫瘤來(lái)源的IgG，我們及前期的報(bào)道已表明，用商品化抗人IgG進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞都有陽(yáng)性反應(yīng)。RP215抗體是用腫瘤細(xì)胞裂解液作為免疫原獲得的，可特異性識(shí)別腫瘤來(lái)源免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一個(gè)特殊唾液酸化表位，而不識(shí)別B細(xì)胞來(lái)源的IgG[9]。所以RP215對(duì)腫瘤來(lái)源的IgG更具有特異性。故本研究進(jìn)一步利用RP215免疫組織化學(xué)染色的方法發(fā)現(xiàn)cancer-IgG在NSCLC中的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，低表達(dá)cancer-IgG患者總生存期顯著長(zhǎng)于高表達(dá)的患者，分析患者臨床特征發(fā)現(xiàn)cancer-IgG與NSCLC患者的臨床分期、T分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表 1 RP215在NSCLC中的表達(dá)及臨床特征分析Tab 1 Association between RP215 expression and clinicopathological features of lung cancer patients

GSEA結(jié)果顯示，高表達(dá)IGHG1樣本富集到了細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用和趨化因子信號(hào)通路。細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules,CAM）是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附作用和信息傳遞的膜蛋白受體，存在于正常細(xì)胞中維持組織正常形態(tài)和功能。CAM表達(dá)異常，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力降低，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[24]。也有研究[25]表明，CAM通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，來(lái)促進(jìn)腫瘤血管的形成，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用和趨化因子信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要的作用[26,27]。高表達(dá)IGHG1樣本富集到的基因集都參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示IGHG1可能通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，來(lái)影響NSCLC患者的疾病進(jìn)程。但是，該分析結(jié)果基于mRNA表達(dá)水平，并不能完全代表信號(hào)通路蛋白水平的改變，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該假設(shè)。

圖 1 對(duì)GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行RAM標(biāo)準(zhǔn)化。A：GSE30219標(biāo)準(zhǔn)化前后對(duì)比圖；B：GSE33532標(biāo)準(zhǔn)化前后對(duì)比圖；C：GSE37745標(biāo)準(zhǔn)化前后對(duì)比圖。Fig 1 Standardization of gene expression.A:The standardization of GSE30219; B: The standardization of GSE33532;C: The standardization of GSE37745.

圖 2 IGHG1在NSCLC中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系。在GEO數(shù)據(jù)集GSE33532（A）和TCGA+GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)（B）中IGHG1在NSCLC中的表達(dá)顯著高于正常肺組織（P＜0.01）。在GSE30219數(shù)據(jù)集（C）和Kaplan-Meier Plotter（D）中的NSCLC數(shù)據(jù)進(jìn)行生存曲線(xiàn)分析，IGHG1高表達(dá)的患者預(yù)后顯著差于低表達(dá)的患者。Fig 2 IGHG1 expression in NSCLC and its correlation with prognosis.The expression of IGHG1 in NSCLC was significantly higher than that in normal lung tissues (P＜0.01) in GSE33532 (A) and TCGA+GTEx datasets (B); In the GSE30219 (C) and Kaplan-Meier Plotter (D) NSCLC with high expression of IGHG1 had significantly worse prognosis than with low expression.

圖 3 Cancer-IgG免疫組化示意圖及與預(yù)后的相關(guān)性（×100）。Cancer-IgG在NSCLC中陰性表達(dá)（A）、弱陽(yáng)性（B）、中度陽(yáng)性（C）和強(qiáng)陽(yáng)性（D）表達(dá)情況；E：高表達(dá)cancer-IgG的NSCLC患者生存期顯著低于低表達(dá)的患者。Fig 3 The immunohistochemistry staining results of cancer-IgG in NSCLC and Kaplan-Meier survival analysis.The expression of cancer-IgG in NSCLC with negative (A)、weak positive (B), moderate positive (C) and strong positive (D); E: The survival of patients with high expression of cancer-IgG in NSCLC was significantly lower than patients with low expression.

圖 4 基于GSE37745樣本的基因富集分析。GSEA結(jié)果顯示IGHG1的高表達(dá)與細(xì)胞黏附分子（A）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用（B）和趨化因子通路（C）有關(guān)。Fig 4 Enrichment plots from gene set enrichment analysis.GSEA results showed that high expression of IGHG1 was associated with cell adhesion molecule (A), cytokine-cytokine interaction (B) and chemokine pathway (C).

綜上所述，cancer-IgG可能通過(guò)細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用和趨化因子信號(hào)通路影響肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且可以作為評(píng)價(jià)NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo)。