藏紅花素預(yù)處理減輕大鼠胃缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系

徐曼秋，蘇貞，甄玲玲，費(fèi)素娟

作者單位：1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221002；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 徐州 221002

胃缺血再灌注（GI-R）損傷是臨床常見的組織器官損傷之一，常見于失血性休克、敗血癥、消化性潰瘍進(jìn)程中的出血、胃腸道缺血性疾病、器官移植等。目前認(rèn)為其發(fā)生與氧自由基過量生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞間的相互作用，線粒體功能障礙，鈣超載等多種因素有關(guān)。組織缺血再灌注損傷過程中各種因素聯(lián)合作用，使得損傷逐漸加重，如不及時(shí)治療，可能會(huì)導(dǎo)致組織壞死。因此尋找減輕缺血再灌注損傷的保護(hù)措施對(duì)于防治器官缺血再灌注損傷具有重要意義。

藏紅花是一種鳶尾科番紅花屬的草本植物，藏紅花素（crocin）是其主要成分，具有保護(hù)心肌、抗腫瘤、抗焦慮抑郁等作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)crocin具有抗氧化作用，其可減少氧自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［2］。此外，藏紅花可通過抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷［3］。因此，有必要探究crocin對(duì)胃缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)自2017年10月至2018年11月研究crocin對(duì)胃缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，從而為胃缺血再灌注損傷的防治提供新的思路和策略。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2014 0007。大鼠每6只1籠，室溫、晝夜節(jié)律條件下飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食24 h，不禁水。所有大鼠處置符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑藏紅花素（crocin）購自Sigma公司，LY294002、TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒、BCl-2、Bax、p-Akt抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司。PCNA小鼠單克隆抗體、超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。crocin使用前用生理鹽水配制成所需濃度，LY294002使用前用DMSO配制成所需濃度。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組取30只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組6只。（1）假手術(shù)組（Sham組）：僅分離腹腔動(dòng)脈，持續(xù)90 min；（2）胃缺血再灌注組（GI-R組）：無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈缺血30 min后，松開動(dòng)脈夾再灌注1 h；（3）溶劑對(duì)照組（Vehicle組）：注射生理鹽水（NS）前10 min腹腔注射DMSO，缺血前30 min腹腔注射NS；（4）藏紅花素預(yù)處理組（crocin組）：缺血前30 min，腹腔注射給藥crocin（15 mg/kg），缺血30 min，再灌注1 h；（5）藏紅花素預(yù)處理聯(lián)合PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002組（crocin＋LY組）：crocin預(yù)處理前10 min，腹腔注射LY294002（20 mg/kg），缺血前30 min crocin預(yù)處理，缺血30 min，再灌注1 h。

2.2 胃缺血再灌注損傷模型建立參照Du等［4］方法并作相應(yīng)改進(jìn)。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪毛消毒后于劍突下沿腹部正中線切開，用無齒平頭鑷把胃提出切口外，打開后腹膜，分離出腹腔動(dòng)脈。用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30 min后去除，恢復(fù)血流再灌注60 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胃，沿大彎側(cè)剪開，置于冰上展平，冰冷的NS沖洗干凈，計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)。

2.3 胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定參照Du等［5］方法加以改進(jìn)。以腺胃區(qū)局限于胃上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍、出血灶的長(zhǎng)度累積計(jì)分：正常為0分，損傷小于1mm計(jì)1分，1～2 mm計(jì)2分，2～3 mm計(jì)3分，余類推。損傷寬度超過1 mm時(shí)分?jǐn)?shù)加倍。每組大鼠損傷分?jǐn)?shù)的平均值為損傷指數(shù)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色法觀察胃黏膜細(xì)胞增殖測(cè)量完損傷指數(shù)的胃沿胃小彎剪開，一半腺胃置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5μm切片，間斷貼片于多聚賴氨酸處理的載玻片上備用。另一半腺胃在冰上快速剪取胃黏膜，置-80℃冰箱備用。免疫組化PCNA染色步驟按北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的超敏二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。光鏡下觀察到胞核內(nèi)有棕色顆粒者，即為陽性細(xì)胞。運(yùn)用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行半定量分析，以陽性細(xì)胞數(shù)占視野中細(xì)胞總數(shù)的百分比作為分析指標(biāo)。

2.5 胃黏膜細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)胃組織石蠟切片（5 μm），常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。余下按TUNEL試劑盒說明書操作完成后，于光鏡下觀察到細(xì)胞完整、體積縮小固縮成團(tuán)或形成凋亡小體、胞核呈棕黃色即凋亡陽性細(xì)胞。分析方法同上。

2.6 胃黏膜組織MDA含量和SOD活性測(cè)定取出已制備好的胃黏膜，用生理鹽水制成10%的勻漿，每個(gè)標(biāo)本取100 μL，用于胃黏膜組織MDA含量的測(cè)定。用生理鹽水制成1%的組織勻漿，每個(gè)標(biāo)本取30 μL，用于測(cè)定胃黏膜組織的SOD活力。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性測(cè)定采用羥胺法。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.7 Western Blot法檢測(cè)胃黏膜組織Bcl-2，Bax，p-Akt蛋白的表達(dá)按Wang等［6］方法加以改進(jìn)。將胃黏膜組織剪碎后，加入蛋白裂解液（每100 mg組織加1 mL裂解液）進(jìn)行勻漿，勻漿后在4℃離心機(jī)離心后取上清即為蛋白提取液。己制備的蛋白提取液測(cè)蛋白濃度后，將各樣品用勻漿液稀釋至相同濃度，加入1/3體積的4×蛋白變性液95～100℃水浴變性5 min；將煮好的蛋白加入上樣孔，保持每個(gè)孔所上的蛋白總量和體積一致；電泳結(jié)束后，以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入3%BSA中室溫封閉2 h；加入一抗（Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶500、p-Akt 1∶1 000），4℃孵育過夜。一抗孵育過夜后，1×TBST洗滌3次×10 min；分別加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗滌3次×10 min后顯色曝光。采用BandScan軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組胃黏膜損傷指數(shù)與Sham組相比，GI-R組胃黏膜損傷指數(shù)增加（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜損傷指數(shù)降低（P＜0.05）。crocin+LY組較crocin組胃黏膜損傷指數(shù)增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組胃黏膜損傷指數(shù)

3.2 各組胃黏膜細(xì)胞凋亡情況與Sham組相比，GI-R組胃黏膜細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。crocin+LY294002組胃黏膜細(xì)胞凋亡率較單用crocin組升高（P＜0.05）。見圖2，3。

圖2 胃黏膜細(xì)胞的凋亡變化（TUNEL法，×400）：A為假手術(shù)組；B為胃缺血再灌注組；C為溶劑對(duì)照組；D為藏紅花素預(yù)處理組；E為藏紅花素預(yù)處理聯(lián)合LY294002組

圖3 胃黏膜細(xì)胞凋亡率的變化

3.3 各組胃黏膜細(xì)胞增殖情況與Sham組相比，GI-R組胃黏膜細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）。crocin+LY294002組胃黏膜細(xì)胞增殖率較單用crocin組降低（P＜0.05）。見圖4，5。

圖4 各組胃黏膜細(xì)胞增殖情況（免疫組織化學(xué)，×400）：A為假手術(shù)組；B為胃缺血再灌注組；C為溶劑對(duì)照組；D為藏紅花素預(yù)處理組；E為藏紅花素預(yù)處理聯(lián)合LY294002組

圖5 胃黏膜細(xì)胞增殖率的變化

3.4 胃黏膜組織MDA含量、SOD活性的變化與Sham組相比，GI-R組胃黏膜組織MDA含量升高、SOD活性降低（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜組織MDA含量降低、SOD活性升高（P＜0.05）。crocin+LY組胃黏膜組織MDA含量較單用crocin組升高、SOD活性降低（P＜0.05）。見圖6。

3.5 各組胃黏膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況與Sham組比較，GI-R組大鼠胃黏膜組織Bcl-2蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)增多（P＜0.05）。與GIR組相比，crocin組大鼠胃黏膜組織Bcl-2的表達(dá)增加（P＜0.05），Bax的表達(dá)減少（P＜0.05）。與單用crocin組比較，crocin+LY組胃黏膜組織Bcl-2的表達(dá)減少（P＜0.05），Bax的表達(dá)增加（P＜0.05）。見圖7。

圖6 胃黏膜組織MDA含量、SOD活性的變化：A為MDA含量變化；B為SOD活性變化

3.6 各組胃黏膜組織p-Akt蛋白表達(dá)情況與Sham組比較，GI-R組大鼠胃黏膜組織p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與GI-R組比較，crocin組p-Akt蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與crocin組比較，crocin+LY組p-Akt蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05），見圖8。提示crocin對(duì)抗大鼠胃缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與其上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路活性有關(guān)。

圖7 各組胃黏膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況：A和B為Bcl-2蛋白表達(dá)情況；C和D為Bcx蛋白表達(dá)情況

4 討論

機(jī)體組織器官正常代謝的維持以及功能與結(jié)構(gòu)的完整性有賴于良好的血液供應(yīng)。各種原因引起的局部組織器官缺血常會(huì)導(dǎo)致局部組織細(xì)胞代謝異常，造成不同程度的損傷。因而為阻止損傷進(jìn)一步加重或促使其恢復(fù)，常需采取各種措施恢復(fù)血液灌注。實(shí)踐證明，這種治療方式在許多情況下取得了良好的效果。但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)，一定條件下恢復(fù)血液再灌后，部分動(dòng)物或病人組織細(xì)胞缺血性損壞未減輕或恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重。研究發(fā)現(xiàn)，這可能與恢復(fù)血液供應(yīng)后，氧自由基生成增多，清除減少，過量的氧自由基攻擊組織內(nèi)的細(xì)胞有關(guān)。生物膜上含有多種脂質(zhì)，脂質(zhì)中又含有各種不飽和脂肪酸，自由基可與脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行過氧化作用，導(dǎo)致膜的運(yùn)輸功能紊亂和喪失。而其中線粒體內(nèi)膜最易受到氧自由基的攻擊。氧自由基可誘發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體內(nèi)膜外的小分子物質(zhì)大量進(jìn)入內(nèi)膜，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)受損和功能紊亂，細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放，激活下游凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7］。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷。膜脂過氧化分解的終產(chǎn)物之一是丙二醛（MDA），因而測(cè)定MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的特異性酶，其活性高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，因而其活性被認(rèn)為是一種評(píng)估抗氧化能力的指標(biāo)。多項(xiàng)研究表明crocin能減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，降低MDA的濃度［8］，增強(qiáng)SOD的活性［9］。本實(shí)驗(yàn)中，crocin組SOD活性較GI-R組升高、MDA含量降低。crocin＋LY組SOD活性較crocin組降低、MDA含量升高。表明crocin可增強(qiáng)胃黏膜組織的抗氧化能力和組織抗損傷的效應(yīng)，而LY294002能抑制其抗氧化的作用。

圖8 各組胃黏膜組織p-Akt蛋白表達(dá)情況：A為蛋白電脈圖；B為各組線條圖

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、黏附、能量代謝、蛋白合成、促生存等過程中起重要作用［10］，酪氨酸激酶受體、非酪氨酸激酶受體、胰島素受體等胞外信號(hào)可激活PI3K。Akt是PI3K信號(hào)通路中一個(gè)重要的下游靶點(diǎn)，PI3K的活化促使第二信使磷脂酰-3，4，5-三磷酸的形成從而進(jìn)一步促進(jìn)Akt的Thr308和Ser473位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而激活 Akt［11］。激活的 Akt可通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子、調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性等多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族是影響細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它包括抗凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如：Bax、Bak、Bad）兩類蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡途徑過度激活在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)線粒體途徑細(xì)胞凋亡的重要分子。缺氧以及缺氧復(fù)氧能夠增加Bax的表達(dá)并使其從胞質(zhì)易位到線粒體，與Bcl-2的同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，增加線粒體膜對(duì)細(xì)胞色素C的通透性，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程［12-14］。而Akt的激活可使Bax的Ser184位點(diǎn)磷酸化，使Bax與Bcl-2解聚，停留在細(xì)胞質(zhì)中與Bcl-xl等形成異源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞存活［15］。本實(shí)驗(yàn)中，與GI-R組比較，crocin提高了p-Akt的蛋白表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，而LY294002可減弱crocin的該作用。說明crocin抑制胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡、對(duì)抗GI-R損傷的作用可能與其上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路活性有關(guān)。

綜上所述，crocin減輕大鼠缺血再灌注損傷的作用機(jī)制可能與其通過上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路活性，清除氧自由基，增強(qiáng)胃黏膜組織的抗氧化能力，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

（本文圖2，4見插圖9-1）