控制性超促排卵治療對(duì)胎盤組織的病理學(xué)影響

呂紅娟 朱新玲 袁倩

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治療的控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是讓多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育成熟，體內(nèi)雌激素水平在一段時(shí)間內(nèi)處于超生理狀態(tài)。促排卵導(dǎo)致的卵巢過(guò)度刺激征(ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS)，特別是重度OHSS是致命的，據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)生率在0.5%～2%之間[1]。我院以正常妊娠母體為對(duì)照，探討控制性超促排卵治療后新鮮胚胎移植以及凍融胚胎移植對(duì)胎盤組織的病理學(xué)影響。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

本研究對(duì)象來(lái)自于2014年1月—2014年12月在青島市婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科門診就診的150名孕婦。其中人工助孕組100例(IVF-ET組和凍融組)，自然妊娠孕婦(正常組)50例。所有參加者均為自愿參加，填寫知情同意書后，為其建立詳細(xì)的病歷登記資料，留存聯(lián)系方式。該研究經(jīng)過(guò)單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁コ醮稳焉?；年齡20～35歲；血常規(guī)、生化、X線胸透和心電圖檢查結(jié)果均正常，夫妻雙方染色體核型均正常。人工助孕組(IVF-ET組和凍融組)均要求不孕原因?yàn)閱渭冚斅压芤蛩鼗蚰蟹揭蛩氐确敲庖咭蛩?；凍融組要求自然周期妊娠；正常對(duì)照組要求妊娠前3個(gè)月未使用任何激素類藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除受孕夫妻任一方有家族遺傳性疾病史及不良妊娠史者；促排卵過(guò)程中發(fā)生OHSS者；孕中晚期出現(xiàn)產(chǎn)科并發(fā)癥，如妊娠期糖尿病、妊娠高血壓或合并甲狀腺功能異常者。

150例孕婦中，7例因后期失訪被剔除，失訪率為4.7%。隨訪過(guò)程中剔除妊娠期合并癥孕婦共22例(IVF-ET組9例，凍融組9例，正常妊娠組4例)， 剩余121例數(shù)據(jù)進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析階段。其中IVF-ET組39例，凍融組40例，正常組42例。

二、研究方法

1.胎盤標(biāo)本采集與處理：胎盤娩出后，在胎盤母體面底板區(qū)的中間帶和中央帶不同部位隨機(jī)取3塊組織，在 4%戊二醛固定液中切成1 mm3的組織塊，經(jīng)固定→脫水→滲透→包埋后用 Leica 超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、硝酸鉛雙重電子染色后，在日立H-7500型透射電鏡下觀察及拍照。

2.終末絨毛的主要觀察指標(biāo)，包括：絨毛間質(zhì)(絨毛水腫，纖維素沉積)以及細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblast，CT)、 合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(syncytiotrophoblast，ST)及其亞結(jié)構(gòu)(微絨毛密度、細(xì)胞漿內(nèi)囊泡、核固縮、鈣化及其他結(jié)構(gòu))。對(duì)所觀察到的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行定量和半定量評(píng)估(表1)。每一例標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)戊二醛固定的組織塊，每一個(gè)組織塊隨機(jī)選取5個(gè)觀測(cè)視野，并在5 000×、12 000×和25 000×放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察和測(cè)量。因此，對(duì)于每一例樣本，共獲得15個(gè)隨機(jī)測(cè)定的指標(biāo)數(shù)據(jù)，借此減少個(gè)體差異。

3. 染色與免疫組化：在胎盤母體面垂直取下約1 cm3大小的組織，立即投入4%中性福爾馬林液中固定24～48 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，待HE染色及免疫組化染色。

表1 評(píng)估合體滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)囊泡、核固縮、鈣化以及絨毛間質(zhì)水腫和纖維素沉積的半定量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Semi-quantitative criteria for the evaluation of cytoplasmic vesicles, nuclear shrinkage, calcification, chorionic stromal edema and cellulose deposition insyncytiotrophoblast cells

4.稱重：胎盤取材后，自胎盤臍帶根部剪除臍帶稱取胎盤重量，記錄新生兒出生體重。

結(jié) 果

1.孕婦年齡、新生兒體重及胎盤指標(biāo)比較

正常妊娠組孕婦平均年齡較IVF-ET組和凍融組孕婦低2歲左右，考慮可能與助孕組孕婦年齡相對(duì)偏大有關(guān)，但三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。IVF-ET組、凍融組與正常妊娠組比較，胎盤重量、新生兒體重差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。通過(guò)線性相關(guān)分析，胎盤重量與新生兒體重具有相關(guān)性(r=0.78，P<0.05)。

2.三組間胎盤絨毛組織定量比較

IVF-ET組、凍融組與正常妊娠組比較，胎盤末梢絨毛血管數(shù)減少，血管占絨毛橫切面積比減小(P<0.05)，IVF-EF組與凍融組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組間絨毛面密度比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。

3.三組間胎盤超微結(jié)構(gòu)比較

通過(guò)半定量統(tǒng)計(jì)對(duì)三組胎盤ST細(xì)胞漿內(nèi)囊泡、核固縮、鈣化以及絨毛間質(zhì)水腫和纖維素沉積進(jìn)行分析(表4)。和正常妊娠組相比，IVF-ET及凍融組來(lái)源胎盤的ST細(xì)胞漿內(nèi)更容易出現(xiàn)囊泡樣及鈣化改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1；余核固縮、絨毛間質(zhì)水腫和纖維素沉積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 孕婦年齡、新生兒體重及胎盤指標(biāo)在三組間的分布情況Table 2 Comparison of maternal age, newborn weight and placenta index in three groups

表3 三組間胎盤絨毛組織定量分析比較Table 3 Quantitative analysis of placental villi in three groups

Note:compared with IVF-ET group and freeze-thaw group,*P<0. 05

表4 三組的胎盤超微結(jié)構(gòu)觀察情況分析[例(%)]

Note:comparison among the three groups,*P<0.05

圖1 IVF-ET組來(lái)源胎盤 ST 細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)中等量囊泡樣改變，Bar=2μmFigure 1 Moderate vesicular changes in the cytoplasm of ST cells from placenta derived from IVF-ET group, Bar=2 μm

正常足月胎盤中約88%的絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞表面，均有發(fā)育良好的微絨毛覆蓋。 ST頂端微絨毛是參與形成母胎交換界面的重要結(jié)構(gòu)，也是母胎循環(huán)之間營(yíng)養(yǎng)成分和代謝廢物交換發(fā)生的主要場(chǎng)所。有報(bào)道指出頂端微絨毛密度和滋養(yǎng)層細(xì)胞成熟度相關(guān)[2]，在外界氧氣和營(yíng)養(yǎng)濃度影響以及體外功能性刺激下發(fā)生變化[3]。微絨毛密度的下降出現(xiàn)在胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限胎盤[4]，先兆子癇胎盤[5]以及其他一些妊娠合并癥胎盤中[2]，提示在這些異常妊娠狀態(tài)中，胎盤微絨毛密度的下降伴有胎盤代謝交換能力的減退。本研究觀察到IVF來(lái)源胎盤出現(xiàn)了明顯的ST頂端微絨毛密度的降低，有些區(qū)域甚至發(fā)生微絨毛的完全丟失，表明IVF來(lái)源胎盤具有較小的屏障交換面積。因此推測(cè)人工助孕組胎盤在發(fā)生過(guò)程中微絨毛密度減少，可能影響胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能。

本研究結(jié)果顯示和正常妊娠組相比，IVF-ET 組和凍融組來(lái)源胎盤 ST內(nèi)出現(xiàn)鈣化的發(fā)生率明顯低于正常妊娠組胎盤，而Lalosevic等[6]則認(rèn)為ART胎盤出現(xiàn)絨毛水腫以及微鈣化的幾率提高。IVF-ET 組和凍融組來(lái)源胎盤ST細(xì)胞漿中出現(xiàn)了中等量的囊泡樣結(jié)構(gòu)。有報(bào)道表明在GDM妊娠胎盤中可觀察到廣泛的囊泡樣改變[7]。而一項(xiàng)利用體外培養(yǎng)模型的研究發(fā)現(xiàn)從足月胎盤分離得到的滋養(yǎng)層細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)，滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)了較多的囊泡樣改變，并伴有葡萄糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的變化[8]。這些被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)異常的表現(xiàn)形式之一[9]。IVF-ET組及凍融組胎盤中出現(xiàn)較多的囊泡樣改變提示其胎盤可能存在滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)異常，并推測(cè)這種異?？赡苁荂OH周期或胚胎操作過(guò)程中局部缺氧所致。但是，到目前為止仍未能有實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧即是引起這些病理改變的直接原因。盡管有上述超微結(jié)構(gòu)的改變，但是IVF-ET組和凍融組胎盤的HE組織學(xué)沒(méi)有顯著改變，超微結(jié)構(gòu)顯示屏障基本結(jié)構(gòu)正常，反映IVF-ET組和凍融組胎兒發(fā)育的宮內(nèi)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、屏障等與自然妊娠胎兒是基本相同的，且IVF-ET組和凍融組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此沒(méi)有證據(jù)證明COH周期是導(dǎo)致IVF-ET 組和凍融組胎盤出現(xiàn)上述改變的原因，關(guān)于胎盤某些超微結(jié)構(gòu)上的差異還需繼續(xù)深入研究。