CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及其信息分析

唐立成 吳宏宇,2 黃青山,*

(1 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433；2 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 201206)

近年來，抗生素濫用導(dǎo)致多重耐藥菌出現(xiàn)頻率大幅提高，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，因此迫切需要尋找抗生素的合適替代品[1]?？股甘且活惪梢允怪虏∥⑸锼劳龅拿?，它最早被定義為通過降解細菌細胞壁從而具有抗菌能力的噬菌體裂解酶[2]，現(xiàn)在一般也將細菌素、自溶素和溶菌酶[3]包含在內(nèi)。CHAP抗生酶是一類含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶。CHAP結(jié)構(gòu)域(CHAP domain)是屬于抗生酶催化域中的一種，與其他抗生酶催化域不同的是，它是一類半胱氨酸、組氨酸依賴性的酰胺水解酶或肽酶(cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidases,CHAP)，一般由110～140個氨基酸組成，在親核攻擊機制中利用催化半胱氨酸殘基發(fā)揮催化活性作用[4]。CHAP結(jié)構(gòu)域由于普遍擁有優(yōu)異的抑菌活性[5]，被應(yīng)用于新型嵌合體抗菌酶的設(shè)計和改造，并且取得了眾多研究成果[6-7]。目前已有一些含CHAP結(jié)構(gòu)域抗生酶的報道，并且對其結(jié)構(gòu)和功能也有了不少研究，例如LysGH15的CHAP結(jié)構(gòu)域首次被確證為是一個EF-hand-like鈣結(jié)合蛋白[8]；通過為PlyTW的CHAP結(jié)構(gòu)域添加SH3b結(jié)合域可以增加CHAP結(jié)構(gòu)域活性[9]等。

相對于已有大量數(shù)據(jù)庫研究的抗菌肽來說，目前抗生酶數(shù)據(jù)庫僅有EnzyBase[10]，phiBIOTICS[11]和GMEnzy[12]3個數(shù)據(jù)庫。它們均未對抗生酶中的CHAP抗生酶進行系統(tǒng)分析，所收集的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)較少甚至沒有。為此，本課題從權(quán)威數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的科學(xué)文獻中收集了1572條含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶，對這些抗生酶進行了詳細注釋和分類，包括蛋白質(zhì)名稱、來源、抗菌活性數(shù)據(jù)、CHAP結(jié)構(gòu)域長度、結(jié)構(gòu)和抗菌活性等信息，并建立了基于Web的數(shù)據(jù)庫，可以直接從瀏覽器訪問和檢索所有數(shù)據(jù)。這些信息不僅可以用作已報道的含有CHAP結(jié)構(gòu)域抗生酶之間的比較，也可以對新型CHAP結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測分析。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

首先通過關(guān)鍵詞("CHAP","enzybiotic","lysin","lysozyme")檢索PubMed中包含CHAP抗生酶實驗的文獻，然后從文獻中抽取CHAP抗生酶信息，同時對UniProtKB蛋白數(shù)據(jù)庫檢索CHAP結(jié)構(gòu)域蛋白，得到初步的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，共計6416條，留作數(shù)據(jù)整理。

1.2 數(shù)據(jù)整理與數(shù)據(jù)庫設(shè)計

對手動收集的文獻與數(shù)據(jù)庫中的CHAP抗生酶信息進行數(shù)據(jù)整合，刪除冗余與不確定信息，參考對應(yīng)的文獻與數(shù)據(jù)庫，最終本研究獲得了1572條含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶。對這些CHAP抗生酶進行信息關(guān)聯(lián)和信息注釋，信息來源于UniProtKB、InterPro、PDB和GO等公共數(shù)據(jù)庫。同時根據(jù)收集到的CHAP抗生酶蛋白序列，運用BioPerl程序包計算CHAP抗生酶的物化性質(zhì)參數(shù)，包括序列長度、分子量、電荷量、pI值等信息。整理后的CHAP抗生酶信息主要包含基本信息、活性信息、序列信息、結(jié)構(gòu)信息和文獻信息。據(jù)此進行對應(yīng)的關(guān)系表設(shè)計，并在MySQL數(shù)據(jù)庫中將其實現(xiàn)。目前數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)收集的截止日期為2018年5月30日。

1.3 Web接口與功能開發(fā)

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫構(gòu)建在一個運行WAMP架構(gòu)的64位的Windows (2008 R2)虛擬服務(wù)器上。服務(wù)器整合了Apache HTTP Server (V2.4.23) Web服務(wù)器和PHP (V5.4.45)以及MySQL Server (V5.5.20)數(shù)據(jù)庫服務(wù)器。所有數(shù)據(jù)保存在MySQL數(shù)據(jù)庫中。服務(wù)器端程序主要使用PHP語言編寫，部分功能使用Perl語言編寫，通過PHP進行功能調(diào)用。前端使用jQuery JavaScript Library (V1.6.2)和Highchart jQuery插件以及Cascading Style Sheets (CSS)技術(shù)實現(xiàn)。Apache、MySQL、PHP、Perl和jQuery都是開源軟件且都是平臺獨立的技術(shù)，非常適合用于學(xué)術(shù)研究。

2 實驗結(jié)果

2.1 CHAP抗生酶數(shù)據(jù)收集與整理結(jié)果

從數(shù)據(jù)庫和文獻信息中收集了1572條CHAP抗生酶，包含1394條來自251種細菌的CHAP抗生酶和178個來自12種噬菌體的抗生酶。數(shù)據(jù)庫對CHAP抗生酶的基本信息、活性信息、序列信息、結(jié)構(gòu)信息和文獻信息進行了詳細描述?；拘畔⒅饕瑏碓?、功能、物化性質(zhì)、數(shù)據(jù)庫鏈接等，結(jié)構(gòu)信息包含結(jié)構(gòu)域信息和三維結(jié)構(gòu)信息。

2.2 數(shù)據(jù)庫設(shè)計結(jié)果

當前CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫主要由5個MySql關(guān)系表組成，分別是Chap、Sequence、Activity、Reference、Domain和Dom2Go表，這些表之間的關(guān)系如圖1所示。Chap表主要保存CHAP抗生酶的基本信息，其中Reference表保存Chap抗生酶相關(guān)的文獻信息，Sequence表和Activity表分別保存CHAP抗生酶的蛋白序列信息和抗菌活性信息，此外，Domain表存儲CHAP抗生酶的結(jié)構(gòu)域信息，而衍生出的Dom2Go表則是保存結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的GO注釋信息。從關(guān)系表模式圖(圖1)可以清晰了解整個數(shù)據(jù)庫的構(gòu)架。

圖1 CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫關(guān)系表模式圖Fig.1 Schema of the CHAP enzybiotic database

2.3 數(shù)據(jù)庫Web接口

數(shù)據(jù)庫Web接口如圖2所示。接口主要包含瀏覽(Browse)、搜索(Search)、統(tǒng)計信息(Statistical Info) 和指南(Guide)。通過瀏覽接口用戶可以瀏覽數(shù)據(jù)庫的所有CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，并且可以在此頁面下載FASTA格式的所有CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，方便用戶進行獨立的數(shù)據(jù)分析和設(shè)計研究。搜索接口主要包含快速搜索和高級搜索。用戶可以使用關(guān)鍵詞進行快速搜索，也可以利用高級搜索功能針對蛋白名稱、來源和靶向目標等進行單一或者組合搜索。數(shù)據(jù)庫提供了數(shù)據(jù)查詢功能，瀏覽和搜索結(jié)果顯示的條目可以對應(yīng)數(shù)據(jù)庫中的每個CHAP抗生酶，每個CHAP抗生酶都有唯一的數(shù)據(jù)庫ID，點擊ID可以鏈接到這一CHAP抗生酶的詳情頁面(圖2)，在詳細信息中記錄了該抗生酶的基本信息、結(jié)構(gòu)域信息、GO注釋信息、3D結(jié)構(gòu)信息、序列信息、活性信息和文獻信息。同時還提供了評論接口供用戶對其進行注釋和交流。

圖2 CHAP數(shù)據(jù)庫Web接口截圖Fig.2 Web interfaces of CHAP enzybiotic database

2.4 數(shù)據(jù)庫中信息分析

2.4.1 抗生酶來源統(tǒng)計

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫收集了1572條CHAP抗生酶，其中1394條CHAP抗生酶來自251種細菌。細菌來源統(tǒng)計如圖3所示，排名前5的細菌來源占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的36.3%(570/1572)。其中大部分來自于革蘭陽性菌鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的27.3%(429/1572)。來自于革蘭陰性菌的CHAP抗生酶主要來自于雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希菌屬(Escherichia)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的9.0%(141/1572)。

對178個來自12種噬菌體的CHAP抗生酶產(chǎn)生的噬菌體種屬的統(tǒng)計(圖4)發(fā)現(xiàn)，CHAP抗生酶主要來自于葡萄球菌噬菌體(Staphylococcusphage)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的8.8%(139/1572)，其次是鏈球菌噬菌體(Streptococcusphage)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的1.5%(24/1572)。

2.4.2 活性統(tǒng)計

對活性數(shù)據(jù)的分析表明，CHAP抗生酶主要對革蘭陽性菌有活性，包括葡萄球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬等。對革蘭陰性菌也有活性，包括軍團菌屬、銅綠假單胞菌屬和沙門菌屬等。

圖3 CHAP抗生酶的細菌來源Fig.3 Bacterial source of CHAP enzybiotics

圖4 CHAP抗生酶的噬菌體來源Fig.4 Bacteriophage source of CHAP enzybiotics

2.4.3 物化性質(zhì)統(tǒng)計

本數(shù)據(jù)庫中的CHAP抗生酶的序列在43～1819個氨基酸長度，最短的CHAP抗生酶SLE-1僅僅有43個氨基酸，僅有1個CHAP結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，而最長的CHAP抗生酶Antireceptor有1819個氨基酸，來自于鏈球菌噬菌體，由2個催化域組成。大部分(1330/1572,84.6%)的CHAP抗生酶分子量介于20～80kDa之間(圖5)，與抗菌肽相比，分子量相對還是較大的。對CHAP抗生酶等電點的統(tǒng)計分析(圖6)顯示，數(shù)據(jù)庫中絕大多數(shù)(1344/1572,85.5%)CHAP抗生酶等電點位于4～11之間，同時也有2個CHAP抗生酶的等電點特別低(＜1)，4個特別高(＞13)，是否具有特別的意義，值得深入研究。

3 結(jié)論和討論

圖5 CHAP抗生酶的分子量分布Fig.5 Distribution of molecular weight for the CHAP enzybiotics

圖6 CHAP抗生酶的等電點分布Fig.6 Distribution of isoelectric points for the CHAP enzybiotics

隨著細菌耐藥問題的日益嚴峻，尋找具有全新作用機制的抗菌物質(zhì)顯得十分重要?？股负涂咕木褪瞧渲斜容^重要的兩種。當前國內(nèi)外已經(jīng)有多種抗生酶和抗菌肽在進行治療耐藥菌感染相關(guān)的臨床試驗[13-14]。國內(nèi)上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司開發(fā)的用于治療燒傷創(chuàng)面金黃色葡萄球菌感染的溶葡萄球菌酶涂劑已經(jīng)完成III期臨床試驗[15]。建立相關(guān)的抗生酶數(shù)據(jù)庫有助于推動此領(lǐng)域的研究，開發(fā)更多的抗生酶用于耐藥菌感染的治療。

目前，針對抗菌肽已建立了非常多的數(shù)據(jù)庫，例如APD[16-18]、ANTIMIC[19]、AMPer[20]、CAMP[21-22]、DAMPD[23]、YADAMP[24]、LAMP[25]、BaAMPS[26]和DRAMP[27]。它們含有許多來自不同來源或特定家族的抗菌肽序列，對抗菌肽的研究提供了巨大的幫助。但對抗生酶進行數(shù)據(jù)庫分類則相對較少，僅有2012年的EnzyBase[10]、2013年的phiBIOTICS[11]和2014年的GMEnzy數(shù)據(jù)庫[12]。其中phiBIOTICS是一個僅針對治療性抗生酶的數(shù)據(jù)庫，只有29個抗生酶及其69項相關(guān)研究信息，數(shù)據(jù)相對較少；EnzyBase最后更新于2012年，收錄了216種來源的1144種抗生酶。GMEnzy收集了157種遺傳修飾的抗生酶。與這些數(shù)據(jù)庫相比，本研究構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫重點研究含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶，針對含有這一類獨有結(jié)構(gòu)的抗生酶進行系統(tǒng)分析整理。其它抗生酶數(shù)據(jù)庫均未對CHAP結(jié)構(gòu)域這一廣泛存在于抗生酶中的活性結(jié)構(gòu)域進行描述和分析，本數(shù)據(jù)庫收錄了目前已有報道的含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶信息。

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫可以幫助科研人員探索CHAP抗生酶的使用和設(shè)計新的抗生酶。通過數(shù)據(jù)庫，可以對所有含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶進行進化分析，了解不同抗生酶的進化關(guān)系，對CHAP結(jié)構(gòu)域的差異性和共同性以及它們的抗菌活性的關(guān)系研究有著重要的意義。建立數(shù)據(jù)庫可以將目前零散的含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶的研究系統(tǒng)化，用戶可以迅速地查找相關(guān)的理化性質(zhì)并進行比較，可以快速找到針對一類或多類特定病原體的CHAP抗生酶，并對它們的活性和作用條件進行篩選。并且本文的數(shù)據(jù)庫也可以為目前熱門的嵌合體抗生酶[28]的研究提供極大的幫助。通過比較和篩選針對特定病原菌的CHAP結(jié)構(gòu)域，可以為研究人員構(gòu)建嵌合體抗生酶提供新的思路。CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建將增加研究這些生物活性蛋白的效率和便利性。

對于潛在藥物來說，活性與毒性信息同樣重要。目前本文的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫，活性數(shù)據(jù)并不全面，并且沒有包含細胞毒性的相關(guān)數(shù)據(jù)。在未來的工作中，本文將專注于收集完善CHAP抗生酶的活性數(shù)據(jù)以及細胞毒性信息，將數(shù)據(jù)庫進一步整合更新，以便更準確地對CHAP抗生酶進行評估。另外，由于目前關(guān)于CHAP抗生酶的結(jié)構(gòu)研究較少，結(jié)構(gòu)信息非常缺乏，我們計劃將一些結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析工具整合入數(shù)據(jù)庫中，以便研究者更好地利用CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫進行CHAP抗生酶設(shè)計和結(jié)構(gòu)功能領(lǐng)域的探索。

致謝：上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司對本研究工作的支持。