淺析芒果屬植物葉綠體DNA提取方法

何飛宇

[摘要]芒果是重要的經(jīng)濟果樹之一，富含多糖、單寧、多酚等次生代謝的干擾物質，不易獲取DNA?；诖?，為提升提取DNA的質量，以芒果屬植物為研究對象，通過對比芒果與扁桃成熟葉片中的DNA質量情況，分析芒果屬植物葉綠體的DNA提取方法。

[關鍵詞]芒果屬;植物葉綠體;DNA;提取方法

[中圖分類號]S667.7[文獻標識碼]B

我國多個芒果屬中芒果的經(jīng)濟效益最高，栽培范圍最廣。我國是栽培芒果的重要國家，并且芒果資源較為豐富，種類已達到1000多種。已有學者采用植物學、生物化學、分子生物學等方式鑒定芒果屬的果類種質與親緣關系，但從總體來看采用植物葉綠體提取芒果屬的DNA較為方便。

1 實驗試劑與過程

實驗地點為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所。實驗的材料為芒果、扁桃。實驗藥品有Buffer I：50 mmol·L-1 Tris C（pH值為8.0），30 mmol·L-1 EDTA，1.2 mol·L-1 NaCl，0.2 mol·L-1 Vc（抗壞血酸），10 g·L-1 PVP即聚乙烯毗咯琳酮C（pH值為3.6）。Buffer II：50 mmol·L-1 Tris（pH值為8.0），30 mol·L-1 EDTA，1.2 mol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 p-琉基乙醇，p=0.1%（W/V）BSA（牛血蛋清白）。Buffer III：120 mmol·L-1 NaCl，80 mmol·L-1 EDTA，10 g·L-1 PVP C（pH值為8.0）。Buffer IV：50 mmol·L-1 Tris（pH值為8.0），30 mmol·L-1 EDTA。TE：0.4 mol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1 Tris-HCl，1.0 mmol·L-1 EDTA。

采用綠色、健康、無病蟲害的葉片數(shù)張，采集后將其放置在預冷的水壺中，然后將其快速帶入實驗室，然后再用干凈的紗布擦拭干凈，應保證葉片干凈后才能開展相關的實驗工作。同時，再用錫箔紙來包裹葉片做好遮光工作，將其放置在4 ℃的環(huán)境內48 h，之后再經(jīng)過液痰后快速進行冷凍處理，然后將其放置在-70 ℃的保存箱內進行備用。

2 實驗具體方法

2.1芒果DNA檢測

提取芒果的基因組質量，與提取材料和材料保存有關。磚紅色的幼嫩芒果葉片材料，含有豐富且高濃度的DNA基因組;由于保存時間或是老化現(xiàn)象，提取DNA基因組時芒果葉片中的單寧、多糖、多酚等一些次生代謝的物質含量較高。提取芒果DNA基因組時，應將材料保存好，并做好前期的材料準備工作，此外也應注重提取芒果基因組DNA的操作技術，確保芒果屬DNA基因組的提取質量，例如采用液氮方法研磨材料。

2.2實驗方法cPDNA的電泳檢測和OD值的測定

實驗時取出2 μL的cpDNA溶液，然后在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并將電泳的緩沖設置為0.5×TBE、電泳設置為45 min、恒壓設置為110 V，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)內觀察測試結果，然后在對成像拍照。針對來自8個擴增不同液體的植物葉綠體DNA的SSR引物，其反應體系為2 μL（5 U·μL-1） Taq DNA Polymerae、1μL（10μmol·L-1）Forword Primer、0.5μL×dNTP、1μL20ng/μL葉綠體DNA，加ddH2O到20μL。其反應程序如下：95 ℃ 5 min、95 ℃ 1 min，退火1 min，退火的溫度因物而異;72 ℃ 2 min，32次循環(huán)，最后72 ℃ 10 min時，電泳檢測檢測PCR產物。

2.3葉綠體的顯微觀察

將1 mL BufferⅡ的溶液與葉綠體融合，并將其放在載玻片上，然后用蓋玻片將其蓋住，將其制成臨時裝片，采用100×油鏡觀察葉綠體。

2.4CTAB的提取法

將CTAB作為提取芒果基因組的DNA，有關研究學者采用這種方法在提取液當中加入PVP粉末和β-的巰基乙醇等一些抗氧化的試劑保護機體組的DNA，避免其與多酚類物質結合。還有的研究學者采用了24∶1的酚氯仿異戊醇混合液抽，經(jīng)過將CTAB提取液進行恒溫水浴后得到了清液，然后將其重復抽提2次，抽提的溶液和上清溶液兩者的體積比例是1∶1，在一般情況下采用飽和酚∶異戊醇∶氯仿=25∶1∶24混合的溶液對其進行抽取，而如果采用這種方法時將飽和酚去除，也能將芒果屬中的高質量基因組的DNA提取出來。

2.5試劑盒提取

采用康為世紀公司的Mango Gen DNA Kit的芒果基因組DNA提取試劑盒，將DNA提取出來，但通過紫外分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)采用這種方法提出芒果基因組DNA的濃度相對較低，并且采用這種方式的投入較大、花費較高。對比試劑盒法、高鹽-低pH法、CTAB提取法提取植物葉綠體DNA的效果，采用DNAout試劑盒法能夠清除物質植被中的蛋白質、多糖、酚類等代謝物質，得出OD230/OD260>2.000，OD280/OD260約1.800，采用高鹽-低pH方法所提取的葉綠DNA的產率較高，高于75.8 ng·μg-1。

2.6 檢測葉綠體DNA中的SSR

采用葉綠體DNAout試劑盒、高鹽低PH的cpDNA等提取方法，并使用SSR引物，選出8對，擴增cpSSR數(shù)量，由此能夠得出采用cpDNA提取方法具有一定的可靠性。

使用扁桃與芒果的cpDNA作為基本模板，使用引物來擴增PCR，通過驗證得出采用以上兩種方法能夠擴增出層次清晰、亮度更好、完整性較好的譜帶。由此能夠得出，采用這兩種方法在提取物質中cpDNA的濃度時較為理想，質量相對較高，能夠將其用于開展后期工作。

2.7 顯微觀察芒果屬的植物葉綠體

采用植物葉綠體的DNAout與高鹽-低pH檢測方法，能夠得出高純度、雜質少、背景清晰的葉綠體顯微成像，因此可以將這兩種方法應用于提取扁桃和芒果DNA葉綠體，但是采用高鹽-PH提出的葉綠體細胞的濃度較高。兩種提取方法的分析結果如表1所示。

2.8 SDS提取

使用高鹽的TE溶液，將0.8 mol·L-1 NaCl加入TE的溶液中，在溶液中加入NaCl能夠檢測樣品中的多糖含量，有效減少溶液中的其他物質造成干擾。通過提升SDS緩沖溶液的濃度，能夠有效減少提取基因組DNA的時間，并且也保障提取基因組DNA的質量。使用這種提取方法能夠不斷增加PCR的含量，但是產物的質量和效率可能會出現(xiàn)不同的結果。此外，也應該合理控制提取的時間與所研磨顆粒的粗細度。

3 結果分析

在研究葉綠體基因組的過程中，提取優(yōu)質的cpDNA是提取芒果屬的前提，采用葉綠體基因組提取方法與全基因組DNA的提取方法相比，cpDNA難度大。cpDNA存在于葉綠體的細胞中，分離難度大;線粒體DNA與核DNA提取cpDNA時，會受到干擾，從而制約了獲取cpDNA效率。在提取cpDNA時，獲得較為完整的葉綠體能保障cpDNA的獲取質量。也可在冰上操作，但要做好研缽經(jīng)液氮預冷工作，由此能減少組織的褐化程度，并保障葉片組織能夠充分凍結，保障葉綠體的完整性。高鹽-低pH的提取率較高，葉綠體DNAout的試劑盒方法操作較為簡單，提取出的cpDNA質量較好。采用這兩種方法都能獲得實驗所要求的cpDNA，從提取的產率角度來看，采用高鹽-低pH的實驗方法相對較好，但從操作簡單和提取質量的角度來看，采用葉綠體DNAout的試驗盒方法較好。

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