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    燈盞乙素對乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs表達(dá)的影響

    2019-01-22 11:55:14云春美金朝仙李美玲倪廣惠
    關(guān)鍵詞:乙素燈盞培養(yǎng)箱

    劉 姣,云春美,金朝仙,李美玲,楊 鴻,倪廣惠

    (云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院,云南 昆明 650500)

    長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs)是一組長度超過200個核苷酸的RNA,不參與蛋白質(zhì)或多肽的編碼[1].目前,對于LncRNAs的認(rèn)識尚處于初級階段,LncRNAs與藥物具有關(guān)聯(lián)[2],一些LncRNAs在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)出現(xiàn)異常,如MALAT1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)[3]在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并促進腫瘤轉(zhuǎn)移,MALAT1缺失小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移減少;NEAT1(Nuclear enriched abundant transcript 1)對于人類的非小細(xì)胞肺癌的增殖、惡化[4]和發(fā)病機制[5]中起重要作用.

    燈盞乙素是云南特色民族藥燈盞細(xì)辛Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand -Mazz的主要有效活性成分,在臨床上用于治療心血管疾病.越來越多研究發(fā)現(xiàn)燈盞乙素具有潛在的治療腫瘤的作用[6-7],其作用機制尚不明確,目前未有燈盞乙素對腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的影響的研究.通過研究燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的lncRNAs的表達(dá)的影響,進一步闡述燈盞乙素對腫瘤細(xì)胞的分子作用機制.

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    燈盞乙素(純度>98%,云南紅河千山生物工程有限公司,批號:20150216);RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司);CellTiter 96?Aqueous細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司);胎牛血清(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司);青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司);RNAiso試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司);Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(瑞士Roche公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);LightCycler?96實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司).

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自于中國科學(xué)院昆明動物研究所.腫瘤細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),加入10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素.細(xì)胞于37℃、5%CO2進行培養(yǎng).

    1.3 細(xì)胞增殖實驗

    取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中,每孔1000個細(xì)胞一共加入培養(yǎng)基100 μL,置CO2培養(yǎng)箱37℃中孵育24 h充分貼壁以后,每孔加入25 μL的含有燈盞乙素的培養(yǎng)基使其終濃度為1、10、25、50、100 μmol/L,其中第3天時候換液,最終燈盞乙素作用于細(xì)胞一共5 d.測定時每孔加入CellTiter 96?Aqueous細(xì)胞增殖檢測試劑25 μL,再在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h.Bio-Rad680型酶標(biāo)儀490 nm測吸光度.每組設(shè)6復(fù)孔,每個實驗分別重復(fù)3次.

    1.4 實時PCR分析

    取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板,每孔7.5×104個細(xì)胞,置CO2培養(yǎng)箱37℃中孵育,接種24 h后加入燈盞乙素.用藥組受試物溶液終濃度分別為1、10、25、50、100 μmol/L.對照組加入等量PBS溶液;每組設(shè)3復(fù)孔,放入37℃CO2培養(yǎng)箱中.每個實驗分別重復(fù)3次.

    細(xì)胞培養(yǎng)5 d后,使用RNAiso試劑盒(Takara),按照說明書對細(xì)胞進行總RNA提取.利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA(1~2 mg)進行cDNA合成,使用羅氏FastStart Essential DNA Green Master和羅氏LightCycler 96?進行熒光定量檢測,PCR引物如表1所示.用β-actin作為對照.條件為1、95℃ 120 s,2、95℃ 10 s,3、60℃ 10 s,4、72℃ 10 s,2~4步驟一共45個循環(huán),使用2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量,2-ΔΔCt的計算方法ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參,-ΔΔCt=-(ΔCt處理-ΔCt對照).

    表1 PCR引物

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

    對照組和處理組采用t檢驗或方差分析.以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn),p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

    將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞置于96孔板中,用不同濃度的燈盞乙素處理5 d.如圖1所示,燈盞乙素低濃度(1、10和25 μmol/L)時促進了細(xì)胞增殖.10 μmol/L時促進作用最強.相反,在50和100 μmol/L的高濃度時,燈盞乙素則會抑制細(xì)胞增殖.隨著劑量上升,燈盞乙素對細(xì)胞增殖的促進作用在10 μmol/L以下是逐漸增強,而超過 10 μmol/L 時則減小.當(dāng)濃度在50 μmol/L以上時,則會轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?

    2.2 燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中LncRNA的影響

    檢測了LncRNAs中MALAT1、NEAT1基因表達(dá)的變化.MALAT1(圖2A)和NEAT1(圖2B)的基因表達(dá)水平在1、10、25和50 μmol/L顯著低于對照組(p<0.05),而在100 μmol/L時顯著高于對照組(p<0.05).

    在1 μmol/L~25 μmol/L時,MALAT1、NEAT1的基因表達(dá)隨著劑量的增加而逐漸下調(diào).相反,在100 μmol/L時,2種lncRNAs的基因表達(dá)上調(diào).

    此外,還測了在不同濃度燈盞乙素處理以后的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中p53基因的mRNA表達(dá)(圖2C).p53基因的mRNA表達(dá)在50 μmol/L及其以下是顯著下調(diào)(p<0.05),而在100 μmol/L濃度下顯著上調(diào)(p<0.05).

    3 討論

    文獻[8]研究表明燈盞乙素在小于10 μmol/L的劑量下不會誘導(dǎo)NaMalwa細(xì)胞凋亡,在15 μmol/L或以上時會誘導(dǎo)其凋亡.本研究顯示燈盞乙素在10 μmol/L時(圖1)對細(xì)胞增殖有明顯的促進作用.當(dāng)劑量小于10 μmol/L時,促進作用增強.在50 μmol/L以上時,促進作用轉(zhuǎn)化為抑制作用.燈盞乙素在100 μmol/L劑量時對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用.

    燈盞乙素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲,并伴隨著基因和蛋白的表達(dá)發(fā)生改變.本研究結(jié)果表明燈盞乙素對MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用,其結(jié)果與增殖作用類似,MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)水平在低劑量時下調(diào),而在100 μmol/L高劑量時顯著上調(diào).

    Li等[9]的研究表明,燈盞乙素降低了人體腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達(dá).Han等[10]的研究顯示了MALAT1的過度表達(dá)明顯降低了MMP-2的表達(dá)水平.本研究證明了燈盞乙素在100 μmol/L時,明顯上調(diào)了MALAT1的表達(dá)水平(圖2A).同時,燈盞乙素在100μmol/L時,通過上調(diào)MALAT1的表達(dá)水平來降低MMP-2的表達(dá)水平,從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖.燈盞乙素是如何調(diào)節(jié)LncRNAs的表達(dá)有待進一步研究.

    燈盞乙素在100 μmol/L時顯著上調(diào)了p53基因的mRNA表達(dá)(圖2C).據(jù)報道,燈盞乙素在100 μmol/L時通過調(diào)節(jié)p53的基因表達(dá),從而增強了caspase-6蛋白的活性[11].

    綜上所述,本研究顯示燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的LncRNAs MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)均產(chǎn)生影響,為進一步深入探索LncRNAs的作用機制提供了依據(jù),并且有助于從分子水平闡明燈盞乙素對腫瘤的作用機制.

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